论文部分内容阅读
背景酒精依赖者在酒精戒断后,不仅表现出失眠、焦虑等症状,也会出现痛觉异常如痛觉超敏。当酒精依赖者进行外科手术后,常需遵医嘱戒断酒精,然而此类病人可能出现与酒精戒断相关的术后疼痛异常。酒精戒断的动物模型通常采用动物被迫或自愿饮酒造成动物酒精依赖后,再减少或停止饮酒。被迫饮酒的方法主要有灌胃、掺酒精液体食物、尾静脉注射、酒精蒸汽和腹腔注射等;自愿饮酒指动物自由地选择饮用不同浓度酒精和水的混合物。术后创口痛动物模型通常采用后足切口手术诱导产生切口痛。一般情况下,术后疼痛表现为急性痛,源于组织损伤和相关炎性反应,仅持续一段时间。然而大约5%到75%的手术患者遭受着术后疼痛慢性化的影响。临床患者的术后疼痛慢性化指手术后持续3个月以上的疼痛,而对于动物模型来说,指术后持续一个月以上的疼痛。术后疼痛慢性化的过程涉及多种不同的生理机制。目前,酒精戒断引起术后痛觉异常类型和机制均少见报道。神经系统的 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体改变是痛觉异常的重要机制之一。AMPA受体作为一种非选择性阳离子通道,在中枢神经系统突触可塑性和兴奋性突触传递均起到重要作用。研究显示,AMPA受体参与术后急性痛、炎性痛等过程,我们的前期研究结果显示AMPA受体参与应激导致的术后疼痛慢性化。另有研究表明,AMPA受体作为酒精的作用靶点,调控神经系统的活动。因此推测AMPA受体可能参与了酒精戒断引起的术后疼痛慢性化过程。N-cadherin和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是AMPA受体激活的相关蛋白。N-cadherin属于钙粘蛋白家族,在神经系统中分布最广,介导Ca2+依赖性的突触间黏附,对AMPA受体的结构和功能起重要作用。CREB是细胞核内重要的转录因子,对中枢敏化的发生和维持至关重要。当cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)和CaMKI和CaMKII等信号通路的激活后,引起CREB磷酸化成为pCREB(phosphorylation of CREB at Ser-133),从而参与中枢敏化发生和维持。目的观察酒精戒断对后足切口手术诱导的术后疼痛的影响,探究脊髓AMPA受体在酒精戒断致术后疼痛慢性化中的作用。方法1、动物分组。将8-10周龄体重20-25g的C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、手术组、酒精戒断组和酒精戒断+手术组。对照组不进行任何手术;手术组采用右侧后足切口手术;酒精戒断组采用酒精处理但不进行手术;酒精戒断+手术组采用酒精处理并后足切口手术。2、酒精戒断。酒精戒断组和酒精戒断+手术组小鼠连续5周饮用酒精,戒断后换成正常饮用水,戒断次日后进行后足切口手术。对照组和手术组始终提供正常饮用水。3、疼痛行为学测试。进行后足切口手术,采用von-Frey纤维测定后足皮肤的方法,分别在术前和术后1、3、5、7、10、20、40、60、80天测定小鼠两侧足底机械刺激撤足阈值(Paw Withdrawal Threshold,PWT)。4、酒精对体外培养的脊髓神经元钙离子内流的影响。取胎龄14-16天的胚胎脊髓神经元进行原代培养,采用25mM酒精孵育体外培养的脊髓神经元,观察其对观察钙离子内流的影响。采用Fruo2AM方法,荧光显微镜下观察在340nm和380nm波长下的荧光强度的Ratio值(F340/F380)。5、观察酒精戒断致术后疼痛慢性化的机制。分别在术后5、50天处死小鼠,取脊髓L4-6段组织,通过Western Blot方法检测脊髓GluA1、GluA2、N-cadherin、CREB和pCREB(Ser133)的蛋白表达。6、统计学分析。采用SPSS 21.0进行统计分析,疼痛行为学采用双因素方差分析,钙成像采用成对t检验,Western Blot采用单因素方差分析,所有数据用均数±标准差(x±s)表示,P<0.05表示有统计学意义。结果1、验证后足切口手术诱导的术后疼痛模型。机械痛行为学结果显示,与对照组相比,手术组小鼠术后第1天到第10天手术侧的PWT显著下降(P<0.05)。对侧的PWT无显著改变(P>0.05)。2、酒精戒断对疼痛行为学的影响。与对照组相比,酒精戒断组的小鼠两侧PWT无统计学意义(P>0.05),并且与Baseline相比,也没有显著差别,提示酒精戒断对正常小鼠疼痛阈值无显著影响。与手术组相比,酒精戒断+手术组小鼠在术后第10天到第60天术侧PWT显著降低(P<0.05),术后第1天到第7天和术后第80天时术侧PWT无统计学意义(P>0.05),提示酒精戒断导致术后切口痛持续时间延长,而对正常小鼠疼痛阈值没有影响。3、酒精孵育导致脊髓神经元钙离子通透性增加,钙内流显著增多(P<0.05),而Ca2+通透型AMPA受体拮抗剂能够阻断酒精诱导的钙内流(P>0.05),提示Ca2+通透型AMPA受体参与酒精诱导的钙内流。4、免疫印迹法检测AMPA受体及其相关蛋白的表达。酒精戒断组的GluA1、N-cadherin和pCREB均与对照组无明显差异(P>0.05)。术后第5天,手术组和酒精戒断+手术组的脊髓GluA1、N-cadhernin和pCCEEB的表达均显著增加(P<0.05),提示脊髓 GluA1、N-cadheirn、pCREB 参与了术后切口痛。但术后第5天手术组和酒精戒断+手术组之间GluA1、N-cadherin和pCREB的表达无显著差异(P>0.05)。术后第50天,手术组的GluA1、N-cadherin和pCREB的表达水平显著下降,与对照组无显著差异(P>0.05),而酒精戒断+手术组的GluA1、N-cadherin和pCREB的表达水平仍显著增加(P<0.05),显著高于手术组,提示脊髓GluA1、N-cadherin、pCREB参与了酒精戒断导致术后疼痛的慢性化。结论酒精戒断可导致后足切口手术诱导的术后疼痛慢性化,脊髓AMPA受体的GluA1亚基、N-cadherin和CREB参与了该过程,而GluA2亚基不参与。