背景:作为一种非外源性抗体依赖的炎症反应,缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury,IRI）是器官获取、器官移植、部分器官切除、创伤及休克等临床实践中难以避免的重要并发症。在肝移植的临床实践中,早期阶段肝脏缺血再灌注损伤常引起肝脏的功能丧失以及功能障碍,同时可能增加急性与慢性排斥反应事件的发生风险,以至最终的移植物衰竭,而进一步加重我国移植供体短缺的现状。在缺血再灌注损伤的过程中,局部血供受阻,肝细胞能量代谢障碍、氧化应激产物的生产,外周中性粒细胞和巨噬细胞的聚集浸润几个过程相互作用,加重了组织损伤并成为导致器官功能丧失的主要原因。作为细胞饥饿状态下的应对措施,自噬通过溶酶体降解受损细胞器和畸形蛋白质,完成细胞内的自我消化,为饥饿的细胞提供必需的底物（氨基酸,脂质和游离脂肪酸）,以维持能量代谢和生物合成。由于肝脏富含溶酶体,因此自噬功能失调与多种肝脏疾病（肝脏IRI,非酒精性脂肪性肝炎和肝癌）有关。在肝移植中,热缺血和冷缺血均主要中断血流/氧气供应,消耗肝细胞三磷酸腺苷并产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）。肝细胞的严重饥饿状态触发自噬信号传导,自噬激活后为细胞提供可重复使用的单体来维持细胞稳态。在IRI过程中,免疫系统与神经系统存在广泛互相作用并形成相互调节机制以维持动态平衡。IRI引起的炎症激活下丘脑系统性神经内分泌调节和区域性神经激素应激反应。神经调节通过刺激迷走神经活动来放大、监测和调节免疫反应,这是一个重要的反馈性回路;在刺激消除后,神经系统又会负性调节局部免疫反应以促进局部环境重回稳态。由ADCYAP1基因编码的垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）正是连接免疫与神经调节的桥梁。PACAP是血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptid,VIP）/胰高血糖素/分泌素家族的成员,在促体垂体区域起神经递质和神经调节剂的作用,并参与促性腺激素的旁分泌和自分泌调节。我们曾报道PACAP和其所有三种受体在IR应激肝脏中表达,并影响肝脏对IR损伤敏感性。而外源性PACAP神经肽也通过减少IR-肝中的中性粒细胞/巨噬细胞集聚和负性调控促炎症介质来调节局部先天性免疫。环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP response element-bing protein,CREB）曾被报道在感染和胰岛素抵抗中发挥先天性免疫调控作用,通过调节的巨噬细胞极化分型消弱TLR4信号通路介导的炎症反应。我们之前也发现,PACAP可以通过增强c AMP-PKA通路与CREB活性来抑制巨噬细胞NF-κB活性。最近,报道称CREB在肝脏自噬调节中有促进脂质自噬降解的功能。Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4,KLF4）是KLF家族至关重要的调控自我更新的转录因子,在增殖、分化和体细胞重编程中发挥着多种调节作用。同时,KLF4通过与Stat6协同诱导M2相关基因表达,并弱化NF-κB激活因子抑制M1表型,对巨噬细胞的极化分型产生影响。另一方面,KLF4通过促进自噬而延长了线虫的寿命,改善小鼠的老年性血管功能障碍,并与CREB在结核分枝杆菌中协同调节免疫的功能引起了我们的研究兴趣。本研究试图阐明在模拟真实临床实践的延长肝冷藏时间后行同系小鼠原位肝移植手术模型中,PACAP介导自噬活动的对肝细胞保护作用,并探讨其在肝脏IRI中促进自噬活动对分子机制,为PACAP在肝移植临床实践中保护肝脏的应用提供理论支持。目的:本研究旨在通过模拟真实临床实践中肝脏供体经过长时间冷藏后行原位肝移植术的小鼠原位肝移植模型来探究PACAP介导肝细胞自噬对肝脏活性的影响与机制。课题假设外源性PACAP通过增强肝细胞内自噬活性,为IR刺激下营养障碍的肝细胞供给细胞代谢所需的底物与能量,以此发挥保护肝细胞的作用。首先,我们想知道PACAP神经肽是否以及如何通过自噬依赖的方式对长时间冷脏的肝脏起保护作用。随后,我们研究了PACAP介导的自噬是否可以在基于临床实践的小鼠原位肝移植模型中保持肝细胞的活力,并促进肝的再生/修复。最后,我们探讨了在肝脏IRI中,PACAP介导的CREB和KLF4共激活对促进肝细胞自噬活动起关键作用,并为将PACAP应用于肝移植的临床实践提供理论支持。方法:1.动物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠（WT）。2.原位肝移植模型。将C57BL/6供体小鼠的肝移植物在4℃UW溶液中保存20 h,然后原位移植到同基因C57BL/6小鼠中。在进行肝移植时以及再灌注之前对受体组予以PBS、PACAP38,或3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理。观察OLT术后存活,并在移植后6小时和24小时收集血清和OLT样品。3.部分肝脏热缺血再灌注损伤模型。用无创伤性夹子夹住肝头叶的动脉和门静脉（占全肝的70%血供）90分钟。单剂量PACAP38、CRP-CREB相互作用抑制剂（CREB抑制剂）或KLF4抑制剂（Kenpaullone）于热缺血前1小时静脉注射。再灌注后6小时收集缺血性肝组织和血清样品。4.肝细胞损伤与功能检测。测定小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平,用以对其进行肝脏受缺血再灌注损伤严重程度的评估。5.组织病理学。获取肝脏样本制成4μm标本,用H&E染色,对肝脏结构损伤情况进行双盲法分析。6.碘化丙锭（PI）染色。PI染色（Thermo Fisher）用于通过结合DNA检测死细胞。将红色荧光图像与明亮视野图像合并以进行盲目评估。7.Real time PCR。提取组织或细胞RNA,用PCR技术对肝脏细胞因子及趋化因子表达情况进行研究和分析,并对PACAP下游分子、自噬和再生修复相关基因进行检测,分析其表达状态。8.Western blot。提取组织或细胞蛋白质,用免疫印迹技术分析OLT模型及IRI模型中关键蛋白在细胞核与细胞质中表达的情况。9.免疫荧光染色。用于分析肝细胞LC3、p CREB和KLF4表的情况。10.ALT/LDH试验。测定体外原代肝细胞培养液中的ALT/LDH水平,用以测定体外培养的原代肝细胞的损伤情况。11.细胞培养。肝胶原酶灌注原位消化后,通过Percoll梯度离心分离原代肝细胞,然后在胶原蛋白包被的平板中培养。12.统计分析。所有实验中的结果均以平均值±标准差（SD）的形式进行表示。并认为p<0.05为有显著统计学意义的差异。结果:1.PACAP可减轻肝冷IRI并并提高小鼠原位移植术后生存率。首先,我们研究了在小鼠同系OLT模型中,给予PACAP神经肽能否对长时间冷藏后行原位肝移植术的供体肝脏其保护作用并延长移植物存活时间。与PBS对照组的41.7%存活率相比,PACAP给药组中91.7%的受体小鼠在OLT后14天仍然存活。由于冷IRI对肝细胞的损伤在再灌注后6h达到高峰,我们在6 h和24 h评估了OLT和血清样品。PACAP显着降低了IRI-OLT,表现为s ALT水平降低和肝脏组织学的完整。2.PACAP促进肝脏自噬。在IR损伤的肝脏中,PACAP增强肝细胞自噬活动。PACAP处理组中自噬关键成分（LC3,Beclin-1和Atg5）的表达量明显高于对照组。同样,PACAP神经肽增加了LC3的表达水平,降低了p62的水平,并促进LC3 I至LC3 II的转化,这被认为是自噬途径中的关键活性步骤。OLT术后6小时肝脏移植物中自噬体的电子显微照片也直观的印证了这个结果。3.PACAP在OLT模型中介导的细胞保护/再生作用依赖于自噬。接着,我们使用自噬抑制剂3-MA来阻断PACAP介导的肝自噬活性,从而验证其在肝脏体内稳态中的重要性。3-MA可阻断IR应激OLT中自噬体的形成。3-MA处理后,LC3I,LC3 II和Beclin-1表达下降,并恢重现OLT中的肝脏IRI,即s ALT水平升高与肝组织学的破坏。另外,我们发现PACAP介导的自噬对肝细胞再生功能有促进作用,提高了PCNA,Ki67,表皮生长因子（EGF）,肝细胞生长因子（HGF）及其受体c-Met的表达;而自噬抑制则消除了这种效果。4.PACAP介导的自噬可防止肝细胞死亡。在过氧化损伤模型中,PACAP处理增强肝细胞核和细胞质中LC3的诱导和积累,保护肝细胞免受氧化应激损伤而凋亡。而自噬抑制作用加剧了肝细胞在该模型中的损害。5.PACAP-CREB轴对于肝脏IRI中PACAP功能至关重要。正如我们在肝IRI中发现PACAP激活PKA-c AMP-CREB信号通路,我们在肝脏OLT中也检测到p CREB的激活,在原代肝细胞体外过氧化损伤模型中观察到一致的结果。不仅如此,我们在小鼠IRI模型中发现,抑制CREB功能可以消除PACAP介导对小鼠肝脏的保护作用。6.PACAP介导的肝细胞自噬需要CREB。相对于PACAP处理促进了肝脏IRI中的肝自噬,PACAP与CREB抑制剂共同给药后,在小鼠IRI模型和原代肝细胞氧化应激中均未能激活自噬相关基因的表达,这说明PACAP介导的肝细胞自噬是CREB依赖的。此外,CREB抑制剂消除了PACAP介导的肝细胞再生活动。7.PACAP-CREB信号通路在肝脏IRI中调控KLF4。与对照组相比,PACAP增强了肝脏IRI模型和体外肝细胞过氧化损伤中的KLF4基因的转录和蛋白质表达。然后,我们在肝IRI模型中使用KLF4抑制剂。与PACAP-CREB阻断类似,抑制KLF4减弱了PACAP介导的细胞保护作用,并恢复了IR诱导的肝细胞损伤,如升高的s ALT水平和肝病理损伤。此外,KLF4的阻断促进了被PACAP-CREB通路下调的促炎性细胞因子,也抑制保护性细胞因子IL-10的表达。8.KLF4对于PACAP-CREB介导的肝细胞自噬通路中不可或缺。KLF4阻断显著减少了肝IRI模型里PACAP处理组原本丰富的肝细胞自噬活动与再生活动。同样,原代肝细胞过氧化模型中PACAP介导的自噬活性和保护作用也被KLF4抑制剂消弱,出现肝细胞损伤与凋亡增加的现象。结论:1.在原位肝移植模型中,PACAP介导的肝细胞自噬活动具有提高肝移植存活率并减轻缺血再灌注损伤的作用。同时有助于提高OLT中肝细胞修复再生功能,减轻IR介导的细胞损伤,减少细胞凋亡/坏死。2.在缺血再灌注损伤中,PACAP通过CREB-KLF4信号通路调节肝细胞自噬功能,发挥对肝细胞的保护作用。同时,在IR肝脏中,PACAP-CREB-KLF4信号通路的完整性对自噬介导的肝细胞保护作用至关重要。