乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的免疫磁珠富集与量子点标记检测

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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌,易于在含有丰富蛋白质和水分以及淀粉含量高的食品中快速繁殖,其产生的金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)又是其重要的致病因子。为了满足食品中致病微生物特异、快速地检出与监测的要求。本论文将纳米磁珠和量子点与传统的免疫方法相结合,利用磁珠的富集作用与量子点的标记,研究出高特异性、高灵敏度的检测平台。研究结论如下:  1安徽不同地区奶牛场牛奶中金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染状况评估从安徽省不同地区的30所奶牛场采集乳样,进行乳源性金黄色葡萄球菌的分离与生化鉴定,并采用PCR技术对分离出的菌株进行金黄色葡萄球菌肠毒素血清型鉴定。通过对各个基因型进行分类比较后得出:乳样中共分离出5株金黄色葡萄球菌,占总比例的16.7%,血清型主要为A、C型,属于中度污染。  2乳源性金黄色葡萄球菌肠毒素A的间接ELISA检测根据已获得的评估结果,从乳样中分离出金黄色葡萄球菌肠毒素A。经纯化鉴定后,利用其作为免疫原,对獭兔进行常规的免疫注射,获得较高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗血清后,建立乳源金黄色葡萄球菌肠毒素间接ELISA检测方法。其线性检测范围为1-103 ng/mL,回收率在98.9861%-103.3475%之间,可用于实际测量。  3金黄色葡萄球菌肠毒素A多克隆抗体免疫磁珠的制备利用油酸法获得分散性好、羧基化、粒径为10nm左右的磁性纳米粒子,并进一步用EDC法活化。然后,将获得的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体与纳米磁珠进行偶联,制备免疫磁珠,在抗体浓度在2 mg/mL时能获得最大固化率。  4羧基荧光量子点的制备及其与抗体偶联条件的筛选通过控制回流反应时间在4h,反应体系pH值在10,制备出荧光强度较高,光稳定性好的羧基CdSe量子点,并对其荧光性能进行表征。用EDC法活化量子点并使其与抗体偶联,得到具有量子点标记的金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗血清。  5金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫磁珠富集与量子点标记检测方法的建立将获得的免疫磁珠与量子点1∶5混合,加入含不同浓度肠毒素牛奶样品进行检测,反应60min,得到其检测限为0.05 ng/mL。
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