[研究背景]近年来随着建筑、交通运输业等经济的不断发展,创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发病率逐年升高。TBI因外力直接或间接作用于头部引起,是一种以轴突破坏,神经元丢失和脱髓鞘为特征的病理事件,主要表现为头痛、恶心、意识障碍、肢体瘫痪等,严重时甚至发生脑疝而危及患者生命,给患者带来极大的安全隐患。TBI是世界各地年轻人死亡和残疾的主要原因,被认为是世界性的重大公共卫生问题。TBI具有高医疗成本、高发病率和高致死率等特点,根据2005年的统计数据,仅在美国每年发病率为200至250万。从疾病发生的病理生理学角度来看,TBI引起的损伤可分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤是由机械性外力冲击的直接效应导致的瞬时损伤,继发性脑损伤是继原发性脑组织机械损伤之后,发生在数小时或数天内,病理过程复杂,包括氧化应激、超氧自由基产生和神经炎症反应等,从而导致神经元损伤和凋亡,因此神经元凋亡是继发性损伤的重要环节。TBI幸存者不仅存在身体残疾,还存在神经行为功能障碍,这都增加了患者对阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的易感性。据世界卫生组织报告,TBI现在已被公认为全球公共卫生流行病,预计到2020年将成为世界上所有年龄组神经残疾的主要原因。在美国,估计每年会接诊110万名TBI患者,其中124,000名患者遗留有长期残疾,50,000名患者死亡,使得TBI成为过早死亡的主要原因。此外,长期医疗保健和收入损失造成相当大的社会和经济负担,这仍然是一个尚未解决的公共卫生问题。目前TBI临床治疗策略主要围绕颅内压、脑灌注、脑血流、脑代谢和脑血管自动调节功能等方面的管理,尚无特效的神经保护药物,因此探索针对TBI后继发性脑损伤具有神经保护作用的药物是TBI治疗非常重要的研究方向。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇痛、镇静和抑制交感神经活性的特性,目前广泛应用于重症患者的镇静治疗。DEX是在20世纪80年代和90年代开发和研究的,近年来大量研究表明DEX具有抗炎、抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用,在神经系统疾病中发挥神经保护作用。课题组前期实验结果也表明右美托咪定预处理能够抑制TBI所致的神经元凋亡,并且表明100ug/kg为最佳治疗剂量,但作用机制尚不明确。沉默信息调节因子 1(silent information regulator family protein 1,SIRT1)是一种保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性组蛋白去乙酰化酶,涉及多种细胞内信号通路,如衰老、炎症、细胞凋亡和自噬,具有神经保护作用,在各种病理动物模型中显示出神经保护作用,包括缺血性脑损伤、创伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血和神经退行性疾病等。有文献表明抑制SIRT1的表达可加重TBI诱导的线粒体损伤,促进神经元凋亡。因此,本文通过DEX预处理和抑制体内SIRT1蛋白的表达,探明右美托咪定是否通过SIRT1信号通路来抑制TBI后神经元凋亡的发生,为右美托咪定治疗TBI的药理机制提供新理论基础。[目的]通过Feeney自由落体法构建SD大鼠TBI模型,探讨DEX是否通过调控SIRT1信号通路抑制TBI大鼠神经细胞凋亡,为临床应用DEX治疗TBI提供理论依据。[方法](1)应用Feeney自由落体法构建SD大鼠TBI模型,实验分组分为4组:Sham组(假手术组,无药物治疗)、TBI+NS组(大鼠造模前1Omin腹腔注射生理盐水)、TBI+DEX组(大鼠造模前10min右美托咪定100μg/kg腹腔注射)、TBI+DEX+EX527组(以5mg/kg的剂量腹腔注射SIRT1特异性抑制剂EX527,在TBI造模前每2d以5mg/kg的剂量腹腔注射EX527,共注射4次,然后在TBI造模前10min给予DEX100μg/kg腹腔注射)。(2)在TBI造模成功后24h,采用mNSS评分标准对各组大鼠进行神经功能评分。(3)神经功能评分完成后,分别进行下述实验:①通过HE染色方法观察各组大鼠皮质损伤区脑组织形态学变化。②采用免疫荧光法检测各组大鼠皮质损伤区SIRT1、Cleaved-caspase3的免疫荧光表达;③采用蛋白质免疫印迹法检测各组大鼠皮质损伤区SIRT1、Bax、Cleaved-caspase3和Bcl-2蛋白表达含量变化。[结果](1)神经功能缺损评分表明,TBI后各组的神经功能缺损评分均较Sham组明显增高(P<0.05)。与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠的神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)。与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠的神经功能缺损评分明显升高(P<0.05)。(2)HE染色:①与Sham组比较,TBI+NS组损伤区脑皮质的神经元发生固缩性坏死,细胞胞体缩小,染色深,部分神经元发生变性、水肿,胞浆空泡形成,核固缩明显;②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组细胞变性、水肿减轻,胞浆空泡减少,神经元损伤减轻;③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527组的神经元损伤严重。(3)免疫荧光检测:1)凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达:①与Sham组比较,TBI+NS 组、TBI+DEX 组和 TBI+DEX+EX527 组的 Cleaved-caspase3 蛋白的荧光表达均显著增加(P<0.05);②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组Cleaved-caspase3蛋白荧光表达显著降低(P<0.05),TBI+DEX+EX527组Cleaved-caspase3蛋白荧光表达轻微降低,但差异无统计学意义(P>0.05);③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527 组 Cleaved-caspase3 蛋白荧光表达显著增加(P<0.05)。2)SIRT1蛋白的表达:①与Sham组比较,TBI+NS组和TBI+DEX组SIRTI蛋白荧光表达显著增加(P<0.05);②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组SIRT1蛋白荧光表达显著增加(P<0.05);③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527组SIRT1蛋白荧光表达显著降低(P<0.05)。(4)蛋白质免疫印迹法检测:1)TBI后各组皮质损伤区促凋亡因子Cleaved-caspase3、Bax 和抗凋亡因子Bcl-2 表达:①与 Sham 组相比,TBI+NS组Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05);②与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达量明显降低(P<0.05);③与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠Bax蛋白表达量明显升高(P<0.05),Cleaved-caspase3蛋白表达量较TBI+DEX组有轻度升高,但无统计学差异(P>0.05)。Bcl-2蛋白表达趋势与Bax基本一致。2)TBI后各组皮质损伤区SIRT1表达:①与Sham组相比,TBI+NS组大鼠SIRT1蛋白表达量升高(P<0.05);②与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠SIRT1蛋白表达量明显升高(P<0.05);③与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠SIRT1蛋白表达量明显降低(P<0.05)。[结论](1)右美托咪定可在一定程度上减轻大鼠TBI的继发性损害,从而发挥神经保护作用。(2)右美托咪定能够通过调控SIRT1信号通路,减少TBI后神经元凋亡的发生。