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据世界卫生组织统计,近年来随着高血压,高胆固醇血症,糖尿病,肥胖,年龄等危险因素的不断出现,AS的发病呈上升趋势,这无疑也增加了心肌梗死,中风,猝死的风险。因而,为达到降低动脉粥样硬化死亡率的最终目标,深入阐明动脉粥样硬化中的细胞内信号转导机制具有重要的意义。众所周知,动脉粥样硬化是威胁人类健康的重要疾病,根据circulation等权威杂志报道的流行病学调查结果显示:动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,在发展中国家是主要的死亡原因。根据现阶段研究表明,巨噬细胞自噬在不稳定斑块的病理过程中发挥重要作用,这为自噬参与动脉粥样硬化提供了一个新的治疗靶点。我们通过Apo E-/-小鼠与Mst1-/-小鼠或Mst1Tg小鼠杂交以产生出Apo E-/-:Mst1-/-小鼠和Apo E-/-:Mst1Tg小鼠。所有的小鼠均给予高脂饮食喂养4个月以诱导出动脉粥样硬化斑块,成熟的巨噬细胞RAW264.7用ox-LDL(50μg/m L)诱导以检测细胞机制。Apo E-/-小鼠的主动脉中Mst1和p-Mst1的表达水平明显增高。与Apo E-/-小鼠相比,Mst1-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积,脂质核心以及聚集的巨噬细胞均明显减少。相反,Mst1过表达增加了斑块面积,脂质核心及巨噬细胞聚集。在主动脉斑块中,Mst1缺乏明显增加了Beclin1和LC3II的表达水平,然而p62的表达水平明显降低。并且,体外数据表明,在ox-LDL的干预下,Mst1缺乏促进典型自噬小体的产生,GFP-m RFP-LC3自噬双标病毒染色显示Mst1缺乏增强了自噬流,在巴甫洛霉素存在的情况下LC3-II表达水平增高p62表达水平降低这一现象依然存在。在ox-LDL的干预下,Mst1缺乏降低巨噬细胞凋亡水平,而Mst1过表达使巨噬细胞凋亡水平增加。由此我们认为,在Apo E-/-小鼠中,Mst1缺乏可以减小动脉粥样硬化斑块面积并且稳定动脉粥样硬化斑块。Mst1通过抑制巨噬细胞自噬增强巨噬细胞凋亡来参与动脉粥样硬化的进展。综上,本研究主要为了解决以下问题:1.探究Mst1在动脉粥样硬化中的作用;2.主要着手于对不稳定斑块的机制研究;3.探究巨噬细胞自噬与凋亡在动脉粥样硬化进展中的作用。【研究目的】通过对Mst1的深入研究使其成为一个治疗动脉粥样硬化的新靶点;进一步探究稳定动脉粥样硬化斑块的机制;通过对巨噬细胞自噬与凋亡之间的关系进行有效调节从而来抑制动脉粥样硬化。【研究方法】1.动物模型构建:ApoE买自美国Jackson公司,Mst1和Mst1 Tg小鼠均是C57BL/6背景。Apo E-/-小鼠分别和Mst1-/-以及Mst1 Tg小鼠杂交以产生出Apo E-/-:Mst1-/-小鼠和Apo E-/-:Mst1 Tg小鼠.8周龄的WT,Apo E-/-,Mst1-/-,Apo E-/-:Mst1 Tg和Apo E-/-:Mst1-/-小鼠均给以高脂喂养4个月(15%脂肪,1.25%胆固醇和0.2%胆酸盐)以此构建小鼠动脉粥样硬化模型。2.HE和油红染色:处死造模成功小鼠,分离主动脉,HE染色遵照说明书要求,主动脉切片在染色前用4%多聚甲醛进行固定.用Image J软件对相对管腔直径,最小管腔直径,斑块面积百分比以及油红染色显示的斑块阳性区域进行分析。3.免疫荧光染色:所有切片经山羊血清封闭1h后按照比例孵育CD68抗体过夜,在室温下孵育二抗1h,经DAPI染核后用共聚焦荧光显微镜拍照,观察切片中巨噬细胞阳性区域面积。4.血清IL-6和MCP-1的检测从高脂喂养4个月后的小鼠收取血清标本,根据ELISA试剂盒说明书检测模型鼠血清中IL-6和MCP-1含量。5.细胞模型构建:成熟巨噬细胞RAW264.7用ox-LDL(50μg/m L)干预24h模拟动脉粥样硬化状态。6.利用GFP-m RFP-LC3自噬双标腺病毒观察巨噬细胞自噬流7.利用透射电镜观察巨噬细胞自噬小体8.利用Tunel试剂盒检测巨噬细胞凋亡情况9.用Western blot检测LC3,p62,beclin1等自噬相关蛋白的表达量。【实验结果】1.缺乏Mst1减少ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化斑块。ApoE-/-,ApoE-/-:Mst1 Tg和Apo E-/-:Mst1-/-小鼠分别经高脂喂养4个月,在主动脉处发现了明显的动脉粥样硬化斑块。HE染色发现,Apo E-/-:Mst1-/-组与Apo E-/-相比,斑块面积减小了72.2%(3.29%±1.16 vs 12.56%±2.71);同时,Apo E-/-:Mst1 Tg组小鼠与Apo E-/-组小鼠相比,斑块面积增大了62%(20.64%±7.02 vs 12.56%±1.16)。同时,Apo E-/-:Mst1-/-组小鼠与Apo E-/-组小鼠相比,最小管腔直径增大,但是斑块面积百分比降低,而Apo E-/-:Mst1 Tg组小鼠与Apo E-/-组小鼠相比,最小管腔直径减小而斑块面积百分比增大。Mst1敲除或过表达对血脂总水平均没有明显影响。2.Mst1缺乏能稳定动脉粥样硬化斑块。油红染色发现,与Apo E-/-小鼠相比,Mst1knockout组阳性区域面积明显减少(6.804%±0.707 vs 15.33%±1.387),相反,Apo E-/-:Mst1Tg组阳性区域面积明显增加(24.85%±2.583 vs 15.33%±1.387)。主动脉斑块切片中巨噬细胞通过免疫荧光染色CD68的表达来表现,与Apo E-/-小鼠相比,Apo E-/-:Mst1-/-小鼠CD68阳性区域面积减少了42.95%(10.61%±1.105 vs 6.054%±0.757,P<0.05),相反,Apo E-/-:Mst1 Tg组和Apo E-/-相比,CD68阳性区域面积明显增加(10.61%±1.105 vs 6.054%±0.757,P<0.05)。用ELISA对各组经高脂喂养4个月后的小鼠血清中IL-6 and MCP-1的含量进行检测,我们发现与Apo E-/-组小鼠相比,Mst1敲除降低了IL-6的表达,而Mst1过表达增加了IL-6的表达,Apo E-/-:Mst1-/-与Apo E-/-组小鼠相比,IL-6的表达降低(21±4.743 pg/m L versus 42.6±7.925 pg/m L,P<0.05);同时MCP-1的表达水平也降低(312±41.32 pg/m L versus 360±41.23 pg/m L,P<0.05)。相反,Mst1过表达增加了IL-6和MCP-1的表达,Apo E-/-:Mst1 Tg与Apo E-/-相比,IL-6表达水平增加(66.6±10.01 pg/m L versus 42.6±7.925 pg/m L,P<0.05);同时MCP-1表达水平也增加(428.4±47.73 pg/m L versus 360±41.23 pg/m L,P<0.05)。3.抑制Mst1增强巨噬细胞中自噬流,透射电镜下发现,经过50 ug/m L ox-LDL干预的巨噬细胞,在加入Ad-sh-Mst1的情况下,可以发现更多双层膜结构即自噬小体形成。同时,和ox-LDL干预组相比,ox-LDL+Ad-Mst组在电镜下自噬小体的数量则明显减少。GFP-m RFP-LC3自噬双标腺病毒能够及时检测自噬小体和自噬溶酶体的形成。红色绿色两种荧光merge后出现的黄色斑点代表自噬小体,merge后出现的红色斑点代表自噬溶酶体,通过对不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。经过ox-LDL干预的巨噬细胞,在导入Ad-sh-Mst1后黄色和红色斑点均明显增加。Western blot检测发现,在bafilomycin A1存在的情况下,增强的自噬流仍然表现为LC3-II表达水平的增加和p62表达水平的下降。在实验中我们发现ox-LDL+Ad-Mst1组表现出了较少的红色和黄色斑点数,LC3-II表达水平下降,p62表达水平增加,这种情况无论在bafilomycin A1存在与否的情况下均会发生。4.用Western blot对Apo E-/-小鼠主动脉中Mst1和p-Mst1的表达水平做了检测。与野生型小鼠相比,Apo E-/-组小鼠主动脉中Mst1和p-Mst1的表达水平均增加。培养的巨噬细胞经ox-LDL干预后Mst1和p-Mst1的表达水平也增加。ox-LDL+Ad-sh-Mst1组Mst1和p-Mst1的表达水平下降,ox-LDL+Ad-Mst1组Mst1和p-Mst1的表达水平增加。在Apo E-/-小鼠中,Mst1-/-后Beclin1,p-Beclin1 and LC3-II的表达水平均增加,而p62表达水平下降。5.在ox-LDL干预的巨噬细胞中抑制Mst1上调降低巨噬细胞凋亡。在实验中我们发现ox-LDL+Ad-sh-Mst1组细胞凋亡水平不明显,定量分析检测发现,与ox-LDL组相比,ox-LDL+Ad-sh-Mst1组巨噬细胞凋亡指数下降(0.146±0.018 vs 0.20±0.03,P=0.009).Bcl-2是抗凋亡家族中的一员,ox-LDL+Ad-sh-Mst1组p136-BAD和Bcl-2表达水平增加,而Bax的表达水平以及Bax/Bcl-2的比值下降。ox-LDL+Ad-Mst1组p136-BAD和Bcl-2表达水平下降,而Bax的表达水平以及Bax/Bcl-2的比值增加【研究结论】本研究为动脉粥样硬化的治疗提供了一个新靶点,即发现Mst1通过抑制自噬参与动脉粥样的进展并且是导致动脉粥样硬化斑块不稳定的一个原因。有效调节巨噬细胞凋亡与自噬可以延缓动脉粥样硬化的进展。