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在脊椎动物和无脊椎动物中,Insulin/IGFs信号系统调控生物个体的生长发育和代谢。这个系统的效应因子具有保守性,特别是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)家族的N端和C端结构域序列高度保守。其对细胞的增殖、分化和凋亡都起着至关重要的作用。Insulin/IGFs系统是当今生物领域的研究热点,其不管是在农业生产还是在疾病治疗方面,都具备有着广阔的应用前景。
家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,不仅具有重要的经济价值,同时也为其它昆虫的研究提供重要的参考。而目前对无脊椎动物IGFBPs的功能同系物少有报道。本论文主要对家蚕Bm8K蛋白进行生物信息学分析,分离纯化Bm8K蛋白,对其功能进行初步研究。主要结果如下:
1.家蚕Bm8K基因的生物信息学分析
根据Bm8K基因组序列,预测它出其由2个外显子和1个内含子构成,其中内含子的长度为578bp,2个外显子的长度分别为193bp和110bp。通过TESS网站预测出以转录起始位点(+1)上游的2500bp区域中有34个可能的胰岛素信号系统相关的转录调控元件。用在线ProtParam软件分析,预测出Bm8K蛋白有5对二硫键,成熟肽的分子量约为8694Da,等电点为8.64。通过对Bm8K蛋白的氨基酸序列BLAST比对发现其与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)的序列具有相似性,特别与IGFBPs的N端功能区域匹配程度较高。
2.家蚕8K蛋白的分离纯化及鉴定
为了获取天然的Bm8K蛋白,将五龄三天的家蚕血液蛋白通过硫酸铵沉淀法,凝胶过滤层析和离子交换层析纯化蛋白。利用MALDI-TOF质谱和Western blotting对纯化得到的蛋白进行鉴定,结果表明纯化得到的蛋白为单一的Bm8K蛋白。
3.家蚕的加糖饲料喂养对Bm8K基因的表达影响
从四龄开始对家蚕用添加了15%的葡萄糖的人工饲料喂养后,提取五龄三天家蚕脂肪体和头的RNA,反转录得到cDNA,以其为模板对Bm8K基因和BombyxinA3基因进行PCR扩增,分析检测它们的表达情况。结果表明,加糖饲料喂养家蚕使Bm8K基因和BombyxinA3基因都得到上调表达。
4.Bm8K蛋白对家蚕卵巢细胞生长情况的影响
用不同浓度(25、50、100μg/mL)的Bm8K蛋白处理对数稳定生长期的卵巢细胞,对照组用等量的PBS处理,培养48h后,用Cell Counting Kit-8对卵巢细胞的生长情况进行检测。结果表明,Bm8K蛋白能够促进家蚕卵巢细胞的生长,这种活性呈剂量依赖性。