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微孢子虫是一种专性细胞内寄生的原生动物,能感染从原生动物到哺乳动物,包括昆虫、鱼类和人类在内的几乎所有的动物,同时又是很有前途的生防制剂。微孢子虫以孢子发芽的方式侵染宿主细胞,孢子发芽是侵染的先决条件,微孢子虫表面蛋白又与孢子发芽以及侵染有关。因此,对微孢子虫侵染相关表面蛋白的研究,对微孢子虫防治和利用具有重要的意义。本论文基于目前对微孢子虫表面蛋白和有关病原微生物侵染宿主细胞的机制等方面的研究成果,通过制备特异识别家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)表面蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,Mab),研究了单抗对Nb孢子体外发芽以及入侵家蚕细胞(Bombyx mori cell,BmN)的影响,发现了一种和Nb孢子体外发芽以及侵染有关的孢子表面蛋白SP84,并对其进行了分离和鉴定,为解明微孢子虫的侵染机制提供了重要依据。
1.制备了特异识别Nb孢子表面蛋白的单克隆抗体。 通过Nb孢子的动物免疫、细胞融合、筛选、克隆和腹水制备,成功制备了7株(1A6、3B1、3C1、3C2、3C3、3C4和3F1)特异识别Nb孢子表面蛋白的单克隆抗体。将制备的7株单克隆抗体分别与成熟Nb孢子、未成熟Nb孢子、成熟内网虫属样小孢子(Endoreticulatus-like microsporadium,简称Esp)和未成熟Esp孢子反应,发现7株单抗和成熟Nb孢子以及未成熟Nb孢子均发生反应,其中单抗1A6还和两种Esp孢子具有免疫交叉反应,可利用单抗将Nb孢子和在生产上影响不大的内网虫属样小孢子准确区分。本研究制备的单克隆抗体效价较高,特异性较好,既可以用来筛选微孢子虫侵染相关表面蛋白,也可有效地用于养蚕生产上的Nb孢子的检测。
2.单克隆抗体预处理Nb孢子可以使孢子的体外发芽率显著降低。 单抗预处理Nb孢子后,用分光光度计法调查了孢子在发芽培养基中的发芽情况。结果发现,单抗3C2、1A6及3C4对Nb孢子体外发芽均有显著的抑制作用(p0.05),而其中以3C2效果最为显著,对Nb孢子体外发芽相对抑制率达到26.4％,而其他单抗对Nb孢子的体外发芽未见有显著的影响(p0.05)。
3.单克隆抗体可以降低Nb孢子对BmN细胞的感染率。 选取对Nb孢子体外发芽抑制能力最强的单抗3C2,将其预处理Nb孢子后,接种BmN细胞,观察Nb孢子对细胞的侵染情况,结合DAPI活体荧光染色法对Nb孢子侵染、增殖的整个过程进行了观察。结果发现,Nb孢子经1mg／mL的单抗3C2预处理以后,与对照组相比,受感染BmN细胞的比率明显下降。从接种12h后开始观察,到96h后孢子感染的细胞破溃,试验组受感染细胞数明显低于对照组。接种后72 h观察发现,此时受感染BmN细胞比率差别最大,经单抗3C2预处理的试验组,受感染细胞的百分比仅为9.1％,而对照组却达到了57.7％,两者差了48.6个百分点。单抗3C2和Nb孢子以及细胞的共培养还显示,3C2对Nb孢子感染BmN细胞还具有长期影响,接种72 h后,预处理组单抗对Nb孢子感染BmN细胞的影响显著下降,而相对而言,共培养组直到接种96 h后,仍然对Nb孢子感染BmN细胞有显著的影响。
4.通过SDS-PAGE、固相2D-PAGE技术以及Western-blotting对单抗3C2识别的Nb孢子表面蛋白进行分子量和等电点的分析,并将其纯化出来。SDS-PAGE显示Nb孢子表面蛋白图谱有11条蛋白带清晰可见：84 kDa、59 kDa、55 kDa、46 kDa、37 kDa、34 kDa、31 kDa、26 kDa、17 kDa、14 kDa和12 kDa。单抗3C2识别的蛋白大小约为84 kDa左右。Nb孢子表面蛋白的2D图谱显示,上样蛋白量为120μg时,Nb孢子表面蛋白约有160多个,Nb孢子的主要蛋白以中性偏酸性小分子(18 kDa,pI 5.4～pI 7.2)居多。单抗3C2识别的抗原蛋白(an 84 kDa surface protein,命名为SP84)分子量约为84 kDa,pI为7.2,从2D胶上看,属于蛋白丰度较低蛋白。
5.间接免疫荧光反应(IFAT)以及免疫胶体金试验显示SP84定位在Nb孢子表面。 单抗3C2的IFAT检测到Nb孢子表面具明亮的翠绿色荧光,孢子经SDS处理后和单抗反应则检测不到荧光。免疫胶体金试验还可以看出抗原分布相对较为分散,呈弥漫性分布,对照组则未见有金颗粒结合于孢子外孢壁。
6.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)结果显示SP84可能和其孢内或孢外蛋白P34存在蛋白质间相互作用。
蛋白SP84经质谱鉴定为gi|19074407|ref|NP 585913.1|hypothetical proteinECU06 15-60[Encephalitozoon cuniculi GB-M1],疑似互作蛋白鉴定为tubulin alpha chain,但由于蛋白覆盖率相对较低,有待进一步证实。对家蚕微孢子虫SP84的深入研究将为解明Nosema属微孢子虫的侵染机制提供重要的科学依据。