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目的:移植后糖尿病作为移植后患者不可避免的术后并发症一直未引起足够的重视。他克莫司作为移植后患者免疫抑制剂的一线用药,其对胰腺的损伤作用机制值得进一步探讨。此外,近些年利拉鲁肽、恩格列净等新型糖尿病药物在糖尿病患者人群中的广泛应用,也为我们进一步探讨其对他克莫司胰岛损伤的保护作用提供了新的思路。方法:(1)GSIS检测他克莫司干预离体胰岛24h后对胰岛素分泌的影响。(2)q RT-PCR检测他克莫司干预离体胰岛24h后对胰岛素分泌相关蛋白的影响。(3)SD大鼠随机分成低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组4组,实验组分别皮下注射0.1、0.5、1.0 mg/kg的他克莫司,连续注射1周,对照组皮下注射等剂量橄榄油。(4)检测大鼠体重、IPGTT、空腹血糖、空腹胰岛素变化。(5)q RT-PCR检测低剂量组中胰岛素分泌相关蛋白的表达。(6)用IPGTT方法比较治疗维持剂量的他克莫司、环孢素A对大鼠糖耐量的影响。(7)SD大鼠随机分为5组,第1周时除对照组以外,其余组均皮下注射他克莫司0.1mg/kg。第2周时,除了继续注射他克莫司外,治疗组分别以灌胃法给予恩格列净10mg/kg,皮下注射法给与利拉鲁肽0.4mg/kg,以及联合治疗法给与恩格列净5mg/kg和利拉鲁肽0.2mg/kg,治疗时间一共2周。(8)记录5组大鼠体重变化、测量IPGTT、空腹血糖、空腹胰岛素、摘取胰岛测胰岛素含量变化。(9)腹腔注射葡萄糖后,检测各时间点血清胰岛素含量。(10)q RT-PCR检测5组间胰岛分泌相关蛋白的表达。(11)免疫荧光染色检测IRS2、Epac2、Glucagon、Insulin的蛋白表达水平。结果:(1)在对离体胰岛的体外干预实验中,与对照组相比,他克莫司10ng/ml组在高糖刺激条件下胰岛素分泌减低了40.79%(P<0.01);(2)离体胰岛q RTPCR结果显示,与对照组相比,他克莫司10ng/ml组Rim2、Rab3a、Snap25、Vamp2、Glucagon的表达量分别增加了41.07%、23.13%、21.55%、96.36%、78.34%(P<0.01)。与对照组相比,Epac2、IRS2、Piccolo、Munck13、Insulin1、Insulin2表达量分别减少73.81%、30.17%、36.51%、11.3%、45.76%、46.03%(P<0.01);(3)在动物试验中,不同剂量他克莫司皮下注射1周后,对照组体重增加了15.87%,0.1mg/kg组体重增加了1.92%,0.5mg/kg组体重下降了4.17%,1.0mg/kg组体重下降了11.14%。与对照组相比,不同剂量他克莫司干预组体重增长都有下降(p<0.001);(4)IPGTT结果显示与对照组相比较0.1mg/kg、0.5mg/kg和1.0mg/kg他克莫司干预组30min,60 min,120min的血糖值均高于对照组(p<0.001)。曲线下面积结果显示,对照组曲线下面积为1355.7±43.55mmol·min/L,0.1mg/kg组曲线下面积为1799.7±107.42 mmol·min/L,0.5mg/kg组曲线下面积为2163.3±103.61 mmol·min/L,1.0mg/kg组曲线下面积为2332.8±52.00 mmol·min/L。他克莫司干预组曲线下面积均大于对照组(p<0.001);(5)不同剂量他克莫司干预组和对照组间FBG、FINS和HOMA-IR无明显差异(p>0.05);(6)免疫组织化学染色结果显示,0.1mg/kg他克莫司组与对照组相比,胰岛素染色面积无明显变化;0.5mg/kg他克莫司组与对照组相比,胰岛素染色面积减少33.55%(p<0.001)。1.0mg/kg他克莫司组与对照组相比,胰岛素染色面积减少36.04%(p<0.001);(7)q RT-PCR结果显示,与对照组相比,0.1mg/kg他克莫司组Epac2、IRS2、Piccolo、Rim2、Rab3a、Snap25、Vamp2、Munck13、Insulin1、Insulin2的m RNA表达量分别减少了58.14%、37.97%、29.98%、42.83%、27.06%、34.88%、20.91%、81.6%、38.96%、56.08%(p<0.01)。与对照组相比,Glucagon的m RNA表达量增多了54.28%(p<0.001);(8)以他克莫司0.1mg/kg、环孢素A 4mg/kg干预大鼠1周后,IPGTT结果显示,0.1mg/kg他克莫司组在30min,60 min,120min血糖值都高于对照组,结果差异具有统计学意义(p<0.01)。环孢素A组各个时间点的血糖数值与对照组并无明显差异(p>0.05)。曲线下面积结果显示,对照组曲线下面积为1319.7±64.56 mmol·min/L,他克莫司组曲线下面积为1811.7±187.51mmol·min/L,环孢素A组曲线下面积为1419.90±32.22 mmol·min/L。他克莫司组曲线下面积大于对照组和环孢素A组,差异具有统计学意义(p<0.001)。环孢素A组曲线下面积与对照组相比无明显差异(p>0.05);一周后测得他克莫司组和环孢素A组的血药浓度分别为3.9ng/ml和125ng/ml,在治疗维持剂量范围内。(9)SD大鼠随机分成5组,分别为对照组(A),他克莫司组(B),他克莫司损伤后恩格列净治疗组(C),他克莫司损伤后利拉鲁肽治疗组(D),他克莫司损伤后恩格列净和利拉鲁肽联合治疗组(E)。3周后,A组体重增加了30.49%,B组体重增加了19.23%,C组体重增加了24.73%,D组体重增加了18.22%,E组体重增加了14.26%。各个干预组的体重增长幅度都小于对照组。其中E组与A组相比体重下降最明显,差异具有统计学意义(p<0.01);(10)IPGTT结果显示,B组30min,60 min,120min的血糖值均高于A组(p<0.001),C、D、E组在30min,60 min,120min的血糖值均低于他克莫司组(p<0.01)。曲线下面积结果显示,A组曲线下面积为1409.75±54.80 mmol·min/L,B组曲线下面积为2206.25±163.88mmol·min/L,C组曲线下面积为1632.00±102.64 mmol·min/L,D组曲线下面积为1454.75±174.86mmol·min/L,E组曲线下面积为1553.25±104.69mmol·min/L。B组曲线下面积大于其余4组(p<0.001)。C组的曲线下面积大于A组,差异具有统计学意义(p<0.001)。D、E组的曲线下面积与A组无明显差异(p>0.05);(11)在腹腔注射葡萄糖后,分别于30min,60min,120min取血测量胰岛素。30min时,A组血清胰岛素含量为1.13±0.15μg/L,B组血清胰岛素含量为0.41±0.04μg/L,C组血清胰岛素含量为0.47±0.06μg/L,D组血清胰岛素含量为0.72±0.12μg/L,E组血清胰岛素含量为0.76±0.09μg/L。B组和治疗组的胰岛素水平都低于对照组(p<0.001)。其中B组和C组的胰岛素水平低于D组、E组(p<0.05);(12)5组间FBG、FINS、HOMA-IR、Insulin content无明显差异;(13)q RT-PCR结果显示,与A组相比,B组的IRS2的m RNA的表达量下降了57.13%(p<0.001)。与B组相比,D组IRS2的表达量增加了79.07%(p<0.001),E组IRS2的表达量增加了44.19%(p<0.001);与A组相比,B组的Epac2的m RNA的表达量下降了69.57%(p<0.001)。与B组相比,D组Epac2的表达量增加了166.18%(p<0.001),E组Epac2的表达量增加了116.67%(p<0.001);与A组相比,B组的Glucagon的m RNA的表达量增加了54.51%(p<0.001)。与B组相比,C组Glucagon的表达量增加了52.26%(p<0.001),D组Glucagon的表达量下降了32.16%(p<0.001),E组Glucagon的表达量增加了16.77%(p<0.001);与A相比,B组的Rim2的m RNA的表达量减少了43.62%(p<0.001)。与B组相比,D组Rim2的表达量增加了53.57%(p<0.01),E组Rim2的表达量增加了62.5%(p<0.001);与A组相比,B组的Snap25的m RNA的表达量减少了37.04%(p<0.001)。与B组相比,C组Snap25的表达量增加了15.87%(p<0.01),D组Snap25的表达量增加了39.68%(p<0.001),E组Snap25的表达量增加了33.94%(p<0.01);与A组相比,B组的Rab3a的m RNA的表达量减少了约23.57%(p<0.01)。与B组相比,C组Rab3a的表达量增加了63.16%(p<0.001),D组Rab3a的表达量增加了38.16%(p<0.001),E组Rab3a的表达量增加了105.26%(p<0.001);与对A相比,B组的GLP-1R的m RNA的表达量下降了16.56%(p<0.01)。与B组相比,C组GLP-1R的表达量增加了66.18%(p<0.001),D组GLP-1R的表达量增加了87.44%(p<0.001),E组GLP-1R的表达量增加了82.80%(p<0.001);(14)免疫荧光结果显示,B组IRS2的表达量为A组的31.48%,D组IRS2的表达量为B组的2.87倍,E组IRS2的表达量为B组的2.55倍(p<0.001)。B组Epac2的表达量为A组的29.81%,D组Epac2的表达量为B组的2.6倍,E组Epac2的表达量为B组的2.66倍,差异均具有统计学意义(p<0.001)。以胰高血糖素-胰岛素免疫荧光双染色法评估各组大鼠胰岛α、β细胞分布与数目,各组间β细胞所占胰岛面积的百分比无明显差异(p>0.05),α细胞占胰岛面积的百分比无明显差异(p>0.05)。结论:(1)体外试验中,在高糖条件下,10 ng/ml他克莫司干预24h可以抑制胰岛素的分泌。(2)SD大鼠用0.1mg/kg剂量的他克莫司皮下注射1周出现糖耐量异常。(3)他克莫司和环孢素A同在维持治疗剂量下,干预大鼠1周,他克莫司比环孢素A具有更强的胰腺毒性。(4)恩格列净和利拉鲁肽联合作用,比单独两种药物使用有更强的减重效果。(5)恩格列净和利拉鲁肽对他克莫司造成的糖耐量异常有治疗作用,利拉鲁肽治疗组、恩格列净和利拉鲁肽联合治疗组的治疗效果优于恩格列净治疗组。具体表现为,利拉鲁肽治疗组、恩格列净和利拉鲁肽联合治疗组胰岛素分泌增多,而且IPGTT曲线下面积小于恩格列净治疗组。(6)他克莫司通过减少IRS2、Epac2的表达,导致胰岛素减少。Piccolo、Rim2、Rab3a、Snap25、Vamp2、Munck13表达的减少可能是由于Epac2的变化导致的连锁反馈效应。(7)利拉鲁肽通过增加IRS2、Epac2的表达,缓解他克莫司对胰岛的损伤。恩格列净通过增加GLP-1R,表现出与利拉鲁肽相同的治疗效果。