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目的:鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）是第二大常见的皮肤恶性肿瘤。全球每年约有SCC新发病例70万例。化学物暴露是SCC发生的重要风险因素之一,阐明化学物致SCC过程中发挥关键作用的调控因子将为该疾病的科学防控提供重要线索。碱性亮氨酸拉链（basic-leucine-zipper,b-ZIP）家族是体内广泛存在、负责调节体内氧化应激反应的核心转录因子家族。NF-E2相关因子1（nuclear factor erythroid 2-related factor 1,Nrf1）是b-ZIP家族的主要成员,在胚胎发育、调节炎症反应和维持蛋白酶体稳态等方面发挥了重要作用。以往研究提示其可能参与了癌症的发生发展。然而,目前关于Nrf1是否参与化学致癌物诱导的皮肤癌的发生发展尚未见报道。因此,本研究利用课题组前期建立的角质形成细胞Nrf1特异性敲除（Nrf1（K14）-KO）小鼠,明确Nrf1在化学致癌物诱导的皮肤肿瘤发生发展中的作用;结合慢病毒稳定转染NRF1基因沉默的人永生化角质形成细胞（Ha Ca T）初步探讨Nrf1发挥抑癌作用的潜在机制,为阐明Nrf1在化学物致皮肤肿瘤中的作用和机制提供新的理论依据。研究方法:1.化学致癌物诱导小鼠皮肤肿瘤模型构建方案的优化以8-10周龄雌性C57BL/6J遗传背景的野生型小鼠为研究对象,对其进行背部皮肤脱毛处理（2 cm×2 cm）,48 h后涂抹7,12-二甲基苯并[a]蒽（7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA）。一周后,于同一脱毛部位涂抹佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,TPA）,每周两次。DMBA和TPA的涂抹浓度分为以下3组,即97.5 nmol DMBA+6.5 nmol TPA;97.5 nmol DMBA+16 nmol TPA;200 nmol DMBA+16 nmol TPA以及丙酮（acetone）溶剂对照组。各组小鼠自TPA涂抹后每周定期监测皮肤肿瘤形成情况,从而筛选建立最优的DMBA/TPA涂抹诱导皮肤肿瘤实验方案。2.角质形成细胞中Nrf1在DMBA/TPA诱导的皮肤肿瘤中的作用采用C57BL/6J遗传背景下的Nrf1-Flox和K14-Cre+/-转基因小鼠进行杂交,构建Nrf1（K14）-KO小鼠,并以其同窝出生的Nrf1-Flox小鼠为对照。按照研究1获取的最优DMBA/TPA涂抹方案,将上述两种基因型的8-10周龄雌性小鼠分别给予DMBA/TPA或Acetone涂抹,每组小鼠5-12只。各处理组小鼠每周测量体重,记录肿瘤负荷（肿瘤出现时间、发生率、大小、个数）,观察终点（TPA处理40周后）收取小鼠血清和皮肤组织样品。3.角质形成细胞中Nrf1缺失对DMBA涂抹诱导的DNA损伤的影响以同窝出生的基因型为Nrf1-Flox和Nrf1（K14）-KO的8周龄的雌性小鼠为研究对象,分别给予小鼠背部皮肤（2 cm×2 cm）Acetone或DMBA涂抹,每组6只,在处理后0 h和24 h收取小鼠背部皮肤,通过免疫组化法测定DNA损伤指标H2AX磷酸化蛋白（γ-H2AX）在表皮层中的表达。通过Image J软件测定小鼠表皮层中的阳性细胞数量。4.NRF1基因沉默在UVB诱导的Ha Ca T细胞DNA损伤修复中的作用分别向携带靶向NRF1 sh RNA的慢病毒（NRF1 knockdown,NRF1-KD）与非靶标阴性对照慢病毒（Scramble）的Ha Ca T细胞给予5 J UVB照射处理后6 h,通过免疫荧光染色评价细胞H2AX磷酸化蛋白（Phosphorylation of H2A histone family member X,γ-H2AX）和p53结合蛋白1（p53 binding protein,53BP1）的表达。分别对Scramble和NRF1-KD的Ha Ca T细胞给予2 J UVB照射处理,收集处理前（Vehicle）和处理后30 min、2 h、6 h和12 h细胞,通过Western blot检测p-ATR、p-CHK1的蛋白表达水平。5.统计分析本研究所有数据均使用Graph Pad Prism 8软件进行数据分析。结果:1.DMBA/TPA涂抹致小鼠皮肤肿瘤模型方案的优化根据不同实验方案组小鼠皮肤肿瘤形成情况,我们发现97.5 nmol DMBA+16nmol TPA组小鼠皮肤肿瘤形成的时间较早,个数较多,因此选择该涂抹方案作为本实验的最终实验方案。2.角质形成细胞特异性Nrf1缺失加重DMBA/TPA所致小鼠皮肤肿瘤接受不同处理的各组小鼠体重正常增长,且各组小鼠体重间差异无统计学意义。TPA和Acetone涂抹后,连续动态记录各组小鼠肿瘤负荷情况发现Acetone处理组小鼠背部皮肤从外观上看均无任何变化,而DMBA/TPA处理组小鼠皮肤肿瘤个数随TPA涂抹时间的延长逐渐增加,且从TPA处理13周开始,Nrf1（K14）-KO小鼠的肿瘤发生率高于Nrf1-Flox小鼠,且差异有统计学意义（P<0.05）。TPA涂抹后20周和40周两个时间点进行的肿瘤直径比较显示:20周时,各直径范围内（1mm-2 mm;2mm-5 mm;≥5 mm）比较,Nrf1（K）-KO小鼠的肿瘤个数均高于Nrf1-Flox小鼠,但仅在2 mm-5 mm直径范围内两组小鼠的差异具有统计学意义（P<0.05）;40周时,上述三组直径范围内的比较结果显示Nrf1（K）-KO小鼠的肿瘤个数均高于Nrf1-Flox小鼠,且各组差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.角质形成细胞特异性Nrf1缺失加重DMBA所致小鼠皮肤DNA损伤DMBA单次处理0 h后,Nrf1（K14）-KO与Nrf1-Flox相比,γ-H2AX阳染细胞无显著差别,DMBA单次处理24 h后,两组小鼠均有γ-H2AX阳染细胞,Nrf1（K14）-KO小鼠表皮的γ-H2AX阳染细胞数目明显高于Nrf1-Flox小鼠,且差异有统计学意义（P<0.05）。4.NRF1基因沉默加重Ha Ca T细胞UVB照射诱导的DNA损伤给予Ha Ca T细胞5 J UVB照射后6小时,通过免疫荧光法测定γ-H2AX及53BP1的表达,发现NRF1敲除细胞（NRF1-KD）的γ-H2AX及53BP1的阳染细胞数目和亮度均高于Scramble细胞。5.NRF1基因沉默影响DNA损伤修复过程中ATR/CHK1信号通路给予2 J UVB照射后,与Scramble组相比,NRF1-KD组细胞的p-ATR蛋白水平无明显改变;但p-CHK1的蛋白水平明显高于Scramble组。结论:1.Nrf1缺失加重DMBA/TPA所诱导的小鼠皮肤肿瘤的发生。2.Nrf1缺失加重DMBA所致小鼠皮肤DNA损伤。3.NRF1沉默抑制UVB照射诱导的p-CHK1的蛋白水平上调。