论文部分内容阅读
家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)是一种重要的病毒,每年给养蚕业生产带来了巨大的经济损失。mi RNAs(micro RNAs)是一类内源性非编码小RNA分子,由18～24个核苷酸组成,具有调节生物体生命活动的作用。本研究采用高通量测序技术对感染Bm BDV 36 h后的3龄幼蚕和对照组样品进行测序,并对测序数据进行生物信息学分析,筛选出24个差异表达的mi RNAs。合成mi RNAs的特异性茎环引物并利用RT-PCR和q RT-PCR的方法验证24个差异表达的mi RNAs,筛选出3个显著差异表达的mi RNAs,并进行组织表达谱的分析。选取其中新发现的novel-mir-16做进一步的研究,通过双荧光素酶报告基因系统验证novel-mir-16的其中4个靶基因,并选取MAN1A1(mannosyl-oligosaccharide alpha-1,2-mannosidase IA)基因做进一步的研究。具体实验结果如下:1、高通量测序结果的生物信息学分析菁松×皓月品种的家蚕3龄起蚕后口服添食Bm BDV,36 h后分别取感染组和对照组的幼蚕,建立小RNA文库,利用高通量测序技术揭示mi RNAs表达谱的变化。分析测序结果:对照组和感染组分别获得了8 084 812和8 465 313条干净序列,将干净序列进行基因组比对,其中对照组占16.9%,感染组占15.36%。并且对干净序列进行分类注释,以及新mi RNAs的预测,共获得273个mi RNAs和24个新mi RNAs,包括24个差异表达的mi RNAs,其中上调和下调的mi RNAs均是12个。利用生物信息学软件预测mi RNAs的靶基因,并且GO分析发现mi RNAs的靶基因主要集中在细胞、催化、结合和代谢过程,仅有少部分参与到凋亡、应激反应和免疫系统过程。2、q RT-PCR验证差异表达的mi RNAs利用茎环RT-PCR和q RT-PCR的方法,鉴定并验证差异表达的24个mi RNAs在3龄幼蚕感染Bm BDV 36 h后和5龄家蚕感染Bm BDV 48 h后中肠组织中的表达水平,从而筛选出幼蚕中显著上调表达的mi R-1923和下调表达的mi R-13b-3p,以及中肠组织中显著上调表达的novel-mir-16。并分析这3个mi RNAs在各个组织中的表达水平,其中mi R-1923在脂肪体中表达最高,mi R-13b-3p和novel-mir-16均在表皮组织中高表达。利用在线软件预测mi R-1923、mi R-13b-3p和novel-mir-16的靶基因,初步推测mi RNAs的潜在作用,为筛选出mi RNA进行深入研究提供理论依据。3、novel-mir-16靶基因的验证家蚕感染Bm BDV后novel-mir-16在中肠组织中显著上调表达,所以我们利用RNAhybrid在线软件预测novel-mir-16与靶基因的结合位点,通过q RT-PCR的方法验证其中9个靶基因在中肠组织中的表达水平。初步筛选出其中4个下调表达的靶基因:MAN1A1、AIF(Apoptosis-inducing factor)、ING5(Inhibitor of growth protein5)、Psat1(Phosphoserine aminotransferase)。利用双荧光素酶报告基因系统在细胞水平进行验证,结果表明:novel-mir-16与AIF、MAN1A1、Psat1编码区的靶位点结合且下调靶基因的表达;与ING5的3’UTR存在结合位点,并负调控靶基因的表达。4、MAN1A1基因功能的初步研究选取MAN1A1基因进一步研究,从而初步探讨novel-mir-16的功能。首先分析MAN1A1的组织差异性表达,结果表明其在脂肪体中显著高表达;然后通过生物学软件对该蛋白进行预测,分析发现该蛋白是一种稳定的、无信号肽但有跨膜结构域的亲水性蛋白。过表达mimics后抑制MAN1A1基因的表达,间接影响部分免疫相关基因下调表达;而过表达MAN1A1后,可能促进免疫相关基因上调表达,说明MAN1A1基因的变化对细胞的免疫过程产生了影响。而家蚕感染Bm BDV后novel-mir-16在中肠组织中上调表达,MAN1A1基因的表达受到抑制,所以我们推测novel-mir-16可能参与到家蚕的先天免疫反应中,具体的调控机制需要进一步的实验验证。以上研究结果,有助于更好地研究差异表达的mi RNAs在家蚕感染病毒过程中的调控作用,为深入研究家蚕与Bm BDV之间的互作机制提供了新的理论依据,也为展开Bm BDV的生物防治提供了新思路。