论文部分内容阅读
[目的]消化道肿瘤发病率居高不下,早发现早治疗是提高肿瘤患者生存率的关键策略。消化内镜检查为诊断消化道肿瘤提供了有效方法,但是,现有消化内镜系统仍然存在微小病灶检测困难、病变边界识别不清等有待进一步解决的问题,术中即时显微成像技术有助于实现术中即时病理诊断,有望提高诊断的准确性。我们研究团队前期在自主研发的高分辨率显微内镜(High-resolution Microendoscopy,HRME)的基础上构建了多光谱荧光显微内镜(Multispectral Fluorescence Endomicroscopy,MFE)原理样机,本研究的目的拟在MFE原理样机基础上进一步工程化升级改造,优化现有的MFE设备,探索MFE工程样机功能及多靶点分子成像的可行性。[方法]1、基于MFE成像原理,通过设计光源模块、多光谱模块、图像采集等模块,设计机械与电控结构,对MFE进行工程化设计研究,实现MFE由原理样机向工程样机的发展。2、选取10只裸鼠,水合氯醛麻醉。其中5只裸鼠经尾静脉注射100μL荧光素钠溶液,5min后剖开进行MFE成像,另外5只相同操作后进行共聚焦激光显微内镜(Confocal Laser Endomicroscopy,CLE)成像,分别观察比较胃体黏膜、胃窦黏膜、小肠黏膜、结肠黏膜、肝脏组织的成像结果。3、免疫组化(Immunohistochemistry,ICH)法检测SGC 7901胃癌细胞中CD44,基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinases 9,MMP 9),血管内皮生长因子(V ascular Endothelial Growth Factor,VEGF),表皮生长因子受体(Epidermal Growt h Factor Receptor,EGFR)四种靶蛋白表达水平,软件评估各自组织化学评分(H istochemical Score,H-score)后,选择得分最高的两种与荧光染料AF680、异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)构建荧光探针。探针为:FITC-抗-EGFR组、AF680-抗-MMP 9组,对照组为磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer ed Saline,PBS)组,将探针与胃癌细胞孵育后进行MFE、荧光显微成像,评估工程样机在细胞水平多光谱分子成像的可行性;构建裸鼠皮下异种移植肿瘤模型,移植瘤表面喷洒探针后MFE进行成像,评估工程样机在动物活体水平多光谱分子成像的可行性。[结果]1、通过对MFE进行模块设计、外观、光机电一体化设计,成功构建MFE工程样机,简化了操作步骤,完成了工程化升级改造。2、MFE成像结果与CLE成像结果类似,可以实现内镜显微成像。3、H-score结果表明MMP 9和EGFR在SGC 7901胃癌细胞中高表达,可作为分子成像的靶点。细胞实验表明:AF680-抗-MMP 9组和FITC-抗-EGFR组肿瘤细胞表面可见明显的荧光信号,平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)分别为69.591±5.699、61.174±8.821,PBS组没有明显信号,结果分别为27.311±3.78、32.087±5.214。荧光显微镜下可见蓝染的肿瘤细胞核以及细胞表面的绿色或红色的荧光信号,但相应的PBS组的细胞表面没有明显信号。移植瘤表面喷洒探针后MFE图像特点是高亮荧光信号,可见大体的瘤体形态,局部放大后信号呈星形,均匀分布于瘤体表面,在FITC-抗-EGFR组和AF680-抗-MMP 9组中,肿瘤MFI分别为76.886±6.748和79.831±4.43;相应的PBS组没有清晰的信号,结果分别为42.976±4.592、36.086±2.042。苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)结果显示该肿瘤为胃癌,瘤体ICH显示EGFR和MMP 9表达。上述探针组和相对应的PBS组之间的比值均不同,并且具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1、成功构建MFE工程样机成像系统,并对其成像功能进行了测试,实现MFE从原理样机到工程样机的优化升级。2、选择EGFR、MMP 9两个靶点构建荧光探针,应用MFE工程样机,在细胞水平实现对SGC 7901胃癌细胞不同靶点的分子成像,证明了MFE工程样机在细胞水平多光谱分子成像的可行性。3、成功实现MFE工程样机对胃癌皮下移植瘤两种靶点的荧光分子成像,结果表明MFE工程样机具备在体多光谱分子成像及在活体进行实时免疫组化的可行性。