大型真菌作为天然活性成分的重要来源,其代谢产物种类丰富,具有多种独特的化学结构和生理活性。本实验以食用真菌为研究对象,围绕其抗氧化活性成分的分离纯化,抗HIV-1和免疫调节活性以及相关作用机制进行研究。本研究首先利用红细胞溶血和脂质过氧化抑制实验,对64株大型真菌的粗提物进行了抗氧化活性测定,确定以黄伞(Pholiota adiposa)子实体作为研究对象。然后利用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、NKA大孔吸附树脂、Sephadex G-15和Sephadex LH-20分子筛凝胶层析以及高效液相色谱(HPLC)等层析方法,首次从黄伞中分离纯化得到三个小分子活性成分PB3、HEB和PC3-3。通过定性试验、质谱、红外光谱以及与相应标准品HPLC保留时间的比对,确定第一个成分为腺苷(adenosine, C10H13N5O4, PB3),第二个成分为没食子酸甲酯(methyl gallate, C8H8O5, HEB),第三个成分为甾体皂苷类化合物(steroidal saponins,PC3-3)。反应浓度为250μg/ml时,PC3-3和HEB对红细胞氧化溶血的抑制率为26.9%和82.4%,抑制脂质过氧化率达88.2%和17.3%,PC3-3和HEB分别在不同的体外检测体系中显示出极强的抗氧化活性。此外,HEB对超氧阴离子和DPPH自由基都具有较强的清除活性,250μg/ml浓度下清除率分别达到71.4%和85.6%。为了大规模筛选具有胞内抗氧化活性的化合物,本实验将具有氧化还原敏感性质的绿色荧光蛋白(redox-sensitive green fluorescent protein, croGFP)基因在大肠杆菌中进行表达,构建了能够通过GFP荧光强度水平定量表征细菌胞内氧化还原水平的检测模型。鉴于抗氧化与抗HIV-1之间的密切关系,进一步将croGFP基因在HIV-1病毒宿主细胞系TZM-BL中进行表达,TZM-BL细胞基因组内整合了HIV-LTR调控的荧光素酶基因luc序列,从而得到了通过GFP荧光强度表征胞内氧化还原水平、荧光素酶活性表征病毒LTR激活水平的抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型。利用大肠杆菌胞内抗氧化筛选模型(E. coli-croGFP),对具有体外抗氧化活性的真菌提取物进行再次检测发现,仅有包括黄伞、红菇、NK2100、猴头、褐孔菌和早北c滑在内的六种食用菌菌丝浸提物能够显示一定的胞内抗氧化活性,证明体外抗氧化成分并不一定能够进入细胞内发挥活性。利用抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型(TZM-BL-croGFP),通过流式细胞仪和发光检测仪对细胞内的GFP荧光强度和Luc酶活性进行检测发现,活性氧刺激使细胞内氧化还原水平升高会直接激活HIV-1启动子LTR调控的下游基因表达,证实了氧化应激与HIV-LTR转录激活之间的直接关系。HEB能够有效地抑制双氧水诱导的胞内氧化应激,抑制率IC50达26.0μM；并且抑制了由于细胞内氧化水平升高引起的HIV-LTR激活,能够将200μM H2O2刺激指示细胞系产生的信号从18.2%降低到2%左右；HEB还能够抑制HIV-1假病毒感染TZM-BL细胞的复制增殖,其抑制率IC50达到11.9μM,证明了抗氧化剂HEB具有抗HIV-1活性。这两个胞内检测模型具有接近生理状态、成本低、操作简单快速、重复性好等优点,适合用于抗氧化、抗HIV-1活性成分的大规模筛选。’为进一步对HEB的抗氧化、抗HIV-1作用机制进行研究,本实验利用Western blot对细胞内核转录因子NF-κB活化情况进行检测发现,H202能够激活细胞内NF-κB活化,促进阻遏蛋白IκB降解,使NF-κB与IκB解离并进入细胞核内行使功能。天然抗氧化成分HEB能够有效抑制NF-κB的活化入核,并防止IκB降解,从而抑制H202引起的氧化应激导致的NF-κB信号途径活化,阻止NF-κB与HIV-1启动子LTR上的κB靶序列结合,抑制病毒复制转录。本研究发现,抗氧化成分HEB具有生物多效性,能够通过多个靶点抑制HIV-1病毒复制。与病毒感染2h完成进入过程后给药相比,HEB预保护能够更好地抑制HIV-LTR激活,证明HEB对病毒感染的进入过程具有一定的抑制作用,但又不仅限于此。进一步利用实验室已有的HIV-1三大关键酶活性检测体系进行实验发现,抗氧化剂HEB对HIV-1逆转录酶和整合酶活性都有不同程度的抑制作用,抑制率IC50分别达到80.1μM和228.5μM,并且在200μM浓度下对HIV-1蛋白酶的抑制率也达到17%左右。所以HEB对HIV-1生长周期中包括病毒进入、逆转录、整合和成熟蛋白加工在内的多个过程产生影响。细胞因子在免疫系统中作用十分重要,黄伞中的活性成分能够调节细胞因子的转录。通过小鼠腹腔给药体内实验,实时定量PCR检测脾细胞内细胞因子的mRNA变化情况,结果发现HEB能够显著提高IFN-γ的表达到两倍以上,同时下调Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达至50%左右,有利于调节艾滋病患者体内Th1/Th2型细胞因子失衡的状态。而PB3则通过提高细胞因子合成抑制因子IL-10的表达至约1.5倍,以及不同程度的下调包括IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6在内的多种细胞因子的表达,体现出较强的抗炎症作用。综上所述,本研究从抗氧化、抗HIV-1和免疫调节三方面对黄伞中的活性成分进行了检测,并且对其活性作用靶点和作用机制进行了研究,同时构建了两种新型抗氧化、抗HIV-1活性胞内检测模型,并对这两种活性之间的关系进行了研究和探讨。具有生物安全性和多效性的天然活性成分为克服HIV-1病毒耐药性提供了新的方向,也为开发新型抗艾滋药物奠定了基础,具有十分重要的研究意义和良好的应用前景。