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子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,在我国仍是一个严重的公共卫生问题。虽然随着“两癌”筛查的普及,宫颈癌的早期检出率大幅提高,其总体发病率及死亡率均有所下降,但宫颈腺癌发病率上升及年轻化的趋势不容忽视。以顺铂为基础的同步放化疗为中晚期宫颈腺癌的标准治疗模式,然而宫颈腺癌对放疗敏感性较差,在铂类药物化疗耐药的情况下,二线及以上治疗晚期宫颈腺癌患者尚无标准治疗方案,且预后极差。为此,探索宫颈腺癌顺铂耐药产生的分子机制,不仅可为其耐药性的克服提供理论依据,而且可为改善宫颈腺癌患者的预后提供新靶点、新途径。基于临床治疗难点,我们前期通过高通量基因芯片方法,筛选出宫颈腺癌细胞（HeLa）和宫颈腺癌顺铂耐药细胞（HeLa/DDP）中存在差异表达的犬尿氨酸酶（kynureninase,KYNU）mRNA,且在宫颈腺癌组织中,化疗耐药组中KYNU及耐药蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达显著高于化疗敏感组,二者的表达呈明显正相关,同时KYNU的高表达预示着更差的预后,表明KYNU可能参与了子宫颈腺癌顺铂耐药的形成。犬尿氨酸酶是色氨酸分解代谢途径中的一种关键酶,大量研究表明KYNU在肿瘤的发生发展和药物敏感性预测中起着重要作用,但KYNU在宫颈腺癌顺铂耐药及恶性进展的中的作用以及其潜在的机制,尚不明确。为此本研究将首先采用实时荧光定量PCR（qPCR）及Western blot（WB）验证KYNU mRNA及蛋白在HeLa及HeLa/DDP细胞中的表达。然后构建KYNU mRNA敲低的稳转HeLa/DDP细胞,WB检测KYNU及P-gp蛋白的表达变化并进行相关功能试验,检测KYNU mRNA敲低对HeLa/DDP细胞在顺铂环境中生物学行为的影响;最后建立裸鼠移植瘤模型,对其进行顺铂腹腔化疗,观察KYNU mRNA敲低对裸鼠移植瘤顺铂化疗的疗效影响,采用免疫组织化学检测KYNU、P-gp、谷胱甘肽巯基转移酶π（glutathione S-transferase π,GST-π）,多药耐药相关蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1,MRP1）、促凋亡调节蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2及钙黏蛋白CD34在裸鼠移植瘤组织中的表达。以明确KYNU mRNA敲低对宫颈腺癌顺铂耐药形成和恶性进展的影响,并初步探讨其潜在机制,为宫颈腺癌顺铂耐药的逆转提供可能的新靶点和途径。第一部分 KYNU mRNA敲低对宫颈腺癌顺铂耐药细胞中KYNU及P-gp蛋白表达及其生物学行为的影响目的:明确KYNU mRNA敲低对宫颈腺癌顺铂耐药细胞中KYNU及P-gp蛋白表达及其生物学行为的影响。方法:采用实时荧光定量PCR（qPCR）及Western blot（WB）验证KYNU mRNA及蛋白在HeLa及HeLa/DDP细胞中的表达。然后构建KYNU mRNA敲低的稳转HeLa/DDP细胞,WB检测KYNU及P-gp蛋白的表达变化,Transwell检测KYNU mRNA敲低后HeLa/DDP细胞在顺铂环境中侵袭和迁移能力变化,CCK-8细胞活力法检测细胞的增殖能力,流式细胞法检测细胞凋亡。结果:1.KYNU mRNA及蛋白在HeLa/DDP中的表达明显高于HeLa本体细胞,差异有统计学意义（P均＜0.05）。2.KYNU mRNA敲低细胞株（GV248-KYNU）及空载体细胞株（GV248-NC）在病毒转染24h后开始有绿色荧光,72h后慢病毒的转染效率达90%左右,2μg/mL嘌呤霉素筛选后转染效率达99%;GV248-KYNU组中KYNU及P-gp蛋白的表达显著低于HeLa/DDP组及GV248-NC组,差异有统计学意义（P均＜0.05）,而GV248-NC组与HeLa/DDP组相比较,KYNU及P-gp蛋白的表达无明显差异（P均＞0.05）。3.KYNU mRNA敲低后,HeLa/DDP细胞在顺铂环境中的侵袭、迁移及增殖能力明显减弱（P均＜0.05）,而细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。结论:KYNU mRNA敲低可下调宫颈腺癌顺铂耐药HeLa/DDP细胞中KYNU及P-gp蛋白的表达,同时使HeLa/DDP细胞侵袭、迁移及增殖能力减弱,细胞凋亡增加,表明KYNU可能参与P-gp介导的宫颈腺癌顺铂耐药,并在其恶性进展中发挥作用。第二部分 KYNU mRNA敲低对裸鼠移植瘤顺铂化疗的疗效影响及潜在机制初步探索目的:裸鼠水平验证KYNU mRNA敲低对整体动物模型中肿瘤生长、转移和耐药性的逆转作用,并初步探讨其潜在机制。方法:1.构建GV248-KYNU、GV248-NC及HeLa/DDP裸鼠移植瘤模型,并根据后期是否行顺铂（Cisplatin）化疗分为 GV248-KYNU-Cisplatin 组、GV248-NC-Cisplatin 组、HeLa/DDP-Cisplatin 组及 HeLa/DDP-生理盐水（Normal Saline,NS）组,每组8只雌性裸鼠。游标卡尺测量皮下移植瘤大小,待移植瘤长至100 mm3左右,进行腹腔顺铂化疗,剂量按照3mg/Kg,隔天一次,共七次,其中HeLa/DDP-NS组腹腔注射生理盐水。每隔3天测一次移植瘤体积及裸鼠体重,至其自然死亡。根据移植瘤体积变化绘制生长曲线并进行生存分析。2.解剖裸鼠观察是否有肿瘤转移,取下瘤体标本后制作石蜡切片,行HE染色观察移植瘤的病理变化情况,并用免疫组织化学检测KYNU、P-gp、GST-π,MRP1、Bax、Bcl-2 及 CD34 的表达。结果:1.成功构建裸鼠皮下移植瘤模型。HeLa/DDP-NS组裸鼠移植瘤生长速度最快,瘤体体积最大。GV248-KYNU-Cisplatin组裸鼠移植瘤生长速度最慢,瘤体体积最小,且与HeLa/DDP-Cisplatin组及GV248-NC-Cisplatin组相比差异有统计学意义（P均＜0.05）;而 GV248-NC-Cisplatin 组和 HeLa/DDP-Cisplatin 组裸鼠移植瘤生长速度及瘤体体积比较无明显差异（P均＞0.05）。2.HeLa/DDP-Cisplatin 组、GV248-KYNU-Cisplatin 组、GV248-NC-Cisplatin三组荷瘤鼠的体重及总生存期无明显差异。HeLa/DDP-NS组荷瘤鼠的体重明显重于其他三组（P均＜0.05）,而其总生存期短于其他组（P均＜0.05）。3.所有组别的裸鼠均未发生肿瘤转移。GV248-KYNU-Cisplatin组与其余三组比较,核染色变浅,癌巢较小,异型性减少,见核分裂像,片状凝固性及灶状坏死样物质较其余三组多。而HeLa/DDP-NS组、HeLa/DDP-Cisplatin组及GV248-NC-Cisplatin组细胞数量多,生长旺盛,核分裂相较多,癌巢大且丰富。4.KYNU mRNA敲低后,KYNU、CD34及耐药相关的蛋白P-gp、MRP1及 GST-π 在 GV248-KYNU-Cisplatin 组中的表达较 HeLa/DDP-Cisplatin 组及GV248-NC-Cisplatin组均显著下调（P均＜0.05）;而促凋亡调节蛋白Bax在GV248-KYNU-Cisplatin 组中的表达较 HeLa/DDP-Cisplatin 组及 GV248-NC-Cisplatin组显著上调（P均＜0.05）,GV248-KYNU-Cisplatin组中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达较HeLa/DDP-Cisplatin组及GV248-NC-Cisplatin组稍上调但差异无统计学意义。结论:KYNU mRNA敲低后,裸鼠移植瘤对顺铂化疗的敏感性提高,肿瘤生长速度减慢,其可能机制是:KYNU mRNA敲低通过上调促凋亡调节蛋白Bax的表达、下调钙黏蛋白CD34及耐药相关的蛋白P-gp、MRP1及GST-π的表达,提高荷瘤鼠对顺铂化疗的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长。