【摘 要】
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非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）引起的猪的一种烈性、高度传染性疾病,对养猪业的危害十分严重。2018年8月,非洲猪瘟病首次传播进入我国并蔓延全中国,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。在非洲猪瘟防控过程中,高效、便捷、敏感的病原检测方法对ASF的诊断和防控具有重要意义。目前,针对ASFV的荧光定
【基金项目】
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企业横向课题,20200410,非洲猪瘟监测与预警分析（2020.04-2021.05）; 江西省教育厅,江西省教育厅科技计划项目,GJJ190192,EP0诱导细胞凋亡的分子机制及其对天然免疫的影响（2019.12至今）; 江西省科技厅,江西省科技计划项目,20202BAB205004,非洲猪瘟病毒P72蛋白抑制Ⅰ型干扰素产生的机制研究（2020.08至今）
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非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）引起的猪的一种烈性、高度传染性疾病,对养猪业的危害十分严重。2018年8月,非洲猪瘟病首次传播进入我国并蔓延全中国,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。在非洲猪瘟防控过程中,高效、便捷、敏感的病原检测方法对ASF的诊断和防控具有重要意义。目前,针对ASFV的荧光定量检测方法已经应用比较广泛,但是,荧光定量方法存在假阳性率高,过度依赖专业的实验室和专业操作人员,无法在养殖场现场进行检测等缺点。针对病毒蛋白的双抗夹心ELISA检测方法操作简便快捷,不需要昂贵设备,能够在养殖场现场进行病原的快速检测,对ASF的临床诊断和防控意义重大。目前,我国在这方面研究仍然较少,也没有商业化试剂盒面市,存在巨大空白。非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的大型双链DNA病毒,编码有151-200种病毒蛋白,其中P72蛋白是病毒外层衣壳的主要成分,在病毒粒子中含量高,序列保守性好,适用于构建双抗夹心ELISA检测方法。本研究利用大肠杆菌原核表达系统表达并且纯化的P72蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了5株抗ASFV P72蛋白的单克隆抗体;结合本实验室保存的抗ASFV P72蛋白的兔多克隆抗体,初步建立了ASFV双抗夹心ELISA检测方法,并且测试了该检测方法的敏感性。具体研究内容如下:1.非洲猪瘟病毒P72蛋白的表达及单克隆抗体的制备根据GenBank上发布的非洲猪瘟病毒Auhui XCGQ株的序列,将合成的P72基因构建至原核表达载体p ET-28a及真核表达载体p CAGGS-Myc中,并分别命名为p ET-28a-P72和p CAGGS-Myc-P72。在大肠杆菌BL21中诱导表达并且纯化重组蛋白P72。以原核表达的重组His-P72蛋白为抗原,免疫6-8周龄的BALB/c小鼠。经过三次亚克隆筛选,获得了5株抗P72蛋白的单克隆抗体,分别命名为2C4B8、2C4C8、5C11D12、5C11F11及7D10C9。Western blot与IFA实验证实制备的单克隆抗体与真核表达的P72蛋白具有良好的反应性与特异性,为建立双抗夹心ELISA检测方法奠定了基础。2.非洲猪瘟病毒双抗夹心ELISA检测方法的初步建立以纯化的鼠单克隆抗体为检测抗体、本实验室保存的兔抗ASFV P72多克隆抗体作为捕获抗体、以及山羊抗鼠Ig G（Ig G-HRP）为标记抗体,初步建立了检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法。其中以单克隆抗体2C4C8与5C11D12为检测抗体,对重组P72蛋白的检测下限为0.25μg/m L;以7D10C9为检测抗体,对重组P72蛋白的检测下限为0.05μg/m L。三株单克隆抗体建立的ELISA方法对不同浓度的P72抗原均表现出较好的线性关系。该方法的建立为ASFV检测试剂的研发提供了方法和物质基础。结论:本研究成功构建了ASFV P72基因的原核表达质粒与真核表达质粒,表达纯化了P72原核重组蛋白;成功制备了5株抗P72蛋白的单克隆抗体,5株单抗均具有良好的特异性与反应性;初步建立了检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法,验证表明建立的双抗夹心ELISA方法具有较好的敏感性。本研究建立的双抗夹心ELISA方法为ASFV抗原ELISA检测试剂盒的研发提供了重要材料,并且打下了实验基础。
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