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微重力诱发的骨丢失及其并发症是宇航员面临的首要风险,因此研究微重力引发骨丢失分子机制及其防护措施具有重要意义。丙谷二肽是临床常用的一种肠内营养剂,主要用于手术创伤的营养补充。有研究显示,丙谷二肽可以用于治疗骨质疏松以及骨关节炎等骨疾病。同时,课题组在前期研究中发现,丙谷二肽对于微重力引发的骨丢失具有很好的防护作用,但其作用机制还有待于进一步研究。肠道微生物作为人体的重要组成,可以影响人体的许多生化反应,进而对人体的生理功能产生影响,甚至与骨质疏松等疾病的发生发展密切相关。有研究发现,宇航员的肠道微生物在微重力环境下会发生显著变化。但是肠道微生物失衡是否与微重力骨丢失有关尚不清楚。基于此,本研究利用微生物组学技术,从肠道微生物的角度探索微重力骨丢失,以及丙谷二肽对微重力骨丢失的防治作用机制。相比于航天试验的高成本,以及人体试验的伦理局限,尾吊大鼠模型具有操作简单,经济成本低,可重复性强等优点,是目前最具可行性的微重力模型,也是研究微重力损伤及防护机制最常见的模型。本研究采用尾吊大鼠建立微重力骨丢失动物模型,利用粪菌移植的方法深入探索丙谷二肽对微重力骨丢失的作用机制。评价指标包括骨质量、骨直径、股骨组织切片等骨质量参数;血清钙、磷、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Bone gla protein,BGP)、骨形态发生蛋白 2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、肿瘤坏死因子 α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及白细胞介素 1β(Interleukin-1β,IL-1β)等骨形成与骨吸收相关生化指标;最后,基于肠道菌群进行物种注释与评估、物种组成分析、β多样性分析等微生物多样性分析。研究主要包括两部分:1、肠道微生物在微重力骨丢失中的作用。SD大鼠分为三组:正常对照组(Normal control group,NC)、尾吊模拟失重组(Simulated microgravity group,SM)和粪菌移植组(Fecal microbiota transplatationgroup,FMT)。粪菌移植大鼠是指每天分离尾吊大鼠肠道菌群,并饲喂给非尾吊大鼠。实验期间各组大鼠自由进食饮水,每三天称重一次。35天后取血,测定各种生化指标。脱颈处死大鼠,分离股骨,进行骨相关测定。分离各组大鼠粪便微生物,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增细菌16S rDNA V-V4可变区,构建PE文库,利用Illumina MiSeq高通量测序平台PE300进行测序,随后进行微生物多样性分析。基于骨质量与血液生化指标实验结果显示,与NC组相比,SM组大鼠股骨直径显著下降;血清钙、ALP、BGP以及BMP-2的含量显著下降;血清磷、TNF-α以及IL-1β的含量显著上升。实验结果表明,尾吊模型可以造成SD大鼠微重力骨丢失。FMT组大鼠股骨直径和血清钙、磷、ALP、BGP、BMP-2、TNF-α以及IL-1β的含量与NC组具有显著差异,与SM组大鼠表现出相同趋势。实验结果显示,模拟失重大鼠粪菌移植可以显著抑制非尾吊大鼠骨形成,促进骨吸收。实验结果表明,肠道微生物是影响微重力骨丢失的关键因素。基于微生物组学实验结果显示,三组样本操作分类单元(Operational Taxonomic unit,OTU)水平共计976个物种,稀释曲线趋于平缓,且覆盖度达到99.65%,说明测序数据达到饱和,能够基本覆盖大鼠肠道菌群物种。物种组成分析结果显示,厚壁菌门和拟杆菌门在三组样本中均为丰度最高的优势物种,但所占比例在各组样本中有所不同。β多样性分析结果显示,各组样本间具有显著差异。多组比较分析结果显示,丰度前15的优势菌属中,有7个属在三组之间具有显著或极显著差异。实验表明,尾吊模拟微重力大鼠肠道菌群发生明显失衡,是造成骨丢失的关键因素。2、基于微生物组学探讨丙谷二肽对空间骨丢失的防护作用SD大鼠分为三组:SM组,模拟失重丙谷二肽给药组(Simulated microgravity and L-alanyl-L-glutamine group,AG)和模拟失重丙谷二肽处理粪菌移植组(Simulated microgravity and fecal microbiota transplatation L-alanyl-L-glutamine group,SFA)。SFA组大鼠是指每天分离AG组大鼠肠道菌群,并饲喂给尾吊大鼠。实验期间各组大鼠自由进食饮水,每三天称重一次。35天后脱颈处死大鼠,分离血液、股骨、大鼠粪便菌群,分别进行生化指标、骨相关指标,以及微生物多样性分析。基于骨质量与血液生化指标实验结果显示,与SM组相比,AG组大鼠股骨直径显著上升;血清钙、ALP、BGP以及BMP-2的含量显著上升;血清磷、TNF-α以及IL-1β的含量显著下降。实验结果表明,丙谷二肽防治SD大鼠微重力骨丢失。SFA组大鼠股骨直径和血清钙、磷、ALP、BGP、BMP-2、TNF-α以及IL-1β的含量与SM组具有显著差异,与AG组大鼠表现出相同趋势。实验结果显示,模拟失重给药大鼠粪菌移植可以显著抑制尾吊大鼠引起的骨形成减少以及骨吸收增加。实验结果表明,丙谷二肽可以通过肠道微生物有效防治空间骨丢失。基于微生物组学实验结果显示,三组样本OTU水平共计1226个物种,稀释曲线趋于平缓,且覆盖度达到99.61%,说明测序数据达到饱和,能够基本覆盖大鼠肠道菌群物种。物种组成分析结果显示,厚壁菌门和拟杆菌门在三组样本中均为丰度最高的优势物种,所占比例在各族中有所不同,但是没有显著性差异。β样性分析结果显示,各组样本间具有显著差异。多组比较分析结果显示,丰度前15的优势菌属中,有1个属在三组之间具有显著差异。实验表明,丙谷二肽引起尾吊模拟微重力大鼠肠道菌群改变是产生防治效果的关键因素。