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第一部分NCI-H460源性肺癌干细胞样细胞的扩增与鉴定目的从体外培养NCI-H460细胞系得到第2代球细胞,与NCI-H460细胞对照,鉴别NCI-H460细胞系第2代球细胞是否具有肺癌干细胞样细胞(lung cancer stem-like cells,LCSLC)性质。方法干细胞条件培养基超低粘附培养板悬浮培养得到NCI-H460细胞系第2代球细胞。肿瘤球形成法对比测定NCI-H460细胞和NCI-H460细胞系第2代球细胞自我更新;创口愈合法和Transwell小室细胞侵袭试验对比检测细胞迁移和侵袭能力;藻红蛋白(PE)标记流式细胞术和蛋白质印迹对比分析肿瘤干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和多能性转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)以及上皮间充质转化(epithelial-mesenchmal transition,EMT)标志物(E-cadherin和N-cadherin)与EMT相关调节因子(Twist1和Snail1)蛋白表达水平;细胞有限稀释裸鼠皮下移植瘤实验对比检查体内致瘤性。结果1.干细胞条件培养基超低粘附培养板悬浮培养获得的NCI-H460源性球细胞能连续传代10代以上,以第2代球细胞第3次球培养得到的肿瘤球形成率最高(P<0.05)。极限稀释法发现单个NCI-H460源性第2代球细胞在第6天能形成典型肿瘤球。2.与NCI-H460细胞相比,NCI-H460细胞系第2代球细胞体外细胞迁移和侵袭能力更强。3.与NCI-H460细胞相比,NCI-H460细胞系第2代球细胞肿瘤干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和多能性转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)蛋白表达水平更高(P<0.05)。4.与NCI-H460细胞相比,NCI-H460细胞系第2代球细胞N-cadherin、Twist1和Snail1上调(P<0.05),同时,E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05)。5.与NCI-H460细胞相比,NCI-H460细胞系第2代球细胞裸鼠体内致瘤能力更强(P<0.05)。小结NCI-H460细胞系第2代球细胞具有LCSLC性质。第二部分Mn SOD/Fox M1高表达在NCI-H460细胞LCSLC特性获得中的作用目的确定Mn SOD/Fox M1高表达是否促成NCI-H460细胞LCSLC功能和特性获得,探讨Mn SOD和Fox M1高表达在肺癌发病机制中的作用。方法利用腺病毒基因递送系统在NCI-H460细胞分别过表达Mn SOD和FOXM1基因或在NCI-H460源性LCSLC分别沉默Mn SOD和FOXM1基因或在NCI-H460源性LCSLC、沉默Mn SOD基因的NCI-H460源性LCSLC过表达FOXM1基因,与表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因NCI-H460细胞或NCI-H460源性LCSLC对照,肿瘤球形成法测定相应基因沉默或过表达细胞肿瘤球形成能力;创口愈合法和Transwell小室细胞侵袭试验对比检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白质印迹对比分析肿瘤干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和多能性转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)以及EMT标志物(E-cadherin和N-cadherin)与EMT相关调节因子(Twist1和Snail1)蛋白表达。结果1.与NCI-H460细胞相比,NCI-H460源性LCSLC的Mn SOD和Fox M1蛋白表达水平更高(P<0.05)。2.与NCI-H460细胞和表达GFP NCI-H460细胞相比,表达Mn SOD NCI-H460细胞Mn SOD和Fox M1蛋白表达水平更高(P<0.05);同时,肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭率增高(P<0.05),CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog、Oct4、Twist1、Snail和N-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)以及E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05)。3.与NCI-H460细胞和表达GFP NCI-H460细胞相比,表达FOXM1 NCI-H460细胞Fox M1蛋白表达水平升高(P<0.05),但不影响Mn SOD蛋白表达水平;同时,肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭率增高(P<0.05),CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog、Oct4、Twist1、Snail和N-cadherin蛋白表达上调以及E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05)。4.与NCI-H460源性LCSLC和表达GFP NCI-H460源性LCSLC相比,表达sh Mn SOD NCI-H460源性LCSLC Mn SOD和Fox M1蛋白表达水平降低,同时,肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭率下降(P<0.05),CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog、Oct4、Twist1和Snail、N-cadherin蛋白表达下调(P<0.05)以及E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)。5.与NCI-H460源性LCSLC和表达GFP LCSLC相比,表达sh FOXM1 NCI-H460源性LCSLC Fox M1蛋白表达水平降低,但不明显影响Mn SOD蛋白表达;同时,其体外球形成、细胞迁移和细胞侵袭率下降,CD133、CD44和ALDH1、Bmi1、Nanog、Oct4、Twist1、Snail、N-cadherin蛋白表达下调以及E-cadherin蛋白表达上调。6.尽管不影响Mn SOD蛋白表达水平,FOXM1基因转导能有效的对抗Mn SOD sh RNA抑制NCI-H460源性LCSLC Fox M1蛋白表达以及LCSLC特性和EMT表型获得作用。小结高表达Mn SOD导致Fox M1表达促进NCI-H460细胞获得LCSLC特性以及EMT表型。第三部分金雀异黄素对NCI-H460细胞、NCI-H460源性LCSLC Mn SOD/Fox M1蛋白表达和LCSLC特性的影响目的确定金雀异黄素能否抑制NCI-H460细胞、NCI-H460源性LCSLC Mn SOD/Fox M1蛋白表达以及LCSLC特性。方法用不同浓度金雀异黄素(10.0、20.0、40.0μM)分别处理NCI-H460细胞或NCI-H460源性LCSLC,肿瘤球形成法测定相应处理细胞自我更新;创口愈合法和Transwell小室细胞侵袭试验对比检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白质印迹对比分析肿瘤干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和多能性转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)以及EMT标志物(E-cadherin和N-cadherin)与EMT相关调节因子(Twist1和Snail1)蛋白表达。结果1.高浓度金雀异黄素(40μM)抑制肺癌H460细胞Mn SOD和Fox M1蛋白表达(P<0.05),肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力(P<0.05)、CD133、CD44和ALDH1、Bmi1、Oct4蛋白表达(P<0.05)和逆转EMT表型(P<0.05)。2.金雀异黄素(10、20、40μM)以浓度依赖方式抑制NCI-H460源性LCSLC Mn SOD和Fox M1蛋白表达(P<0.05),肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力(P<0.05),CD133、CD44和ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达(P<0.05)和逆转EMT表型(P<0.05)。小结金雀异黄素抑制NCI-H460细胞、NCI-H460源性LCSLC Mn SOD/Fox M1蛋白表达和LCSLC特性及EMT表型获得。第四部分金雀异黄素调控Mn SOD/Fox M1表达抑制NCI-H460源性LCSLC特性机制研究目的阐释金雀异黄素通过调控Mn SOD和Fox M1蛋白表达抑制NCI-H460源性LCSLC干性和逆转NCI-H460源性LCSLC EMT表型作用分子机制。方法金雀异黄素(10μM)分别联合Mn SOD或FOXM1基因过表达或沉默NCI-H460源性LCSLC,肿瘤球形成法测定相应处理细胞肿瘤球形成率;创口愈合法和Transwell小室细胞侵袭试验对比检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白质印迹对比分析肿瘤干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和多能性转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)以及EMT标志物(E-cadherin和N-cadherin)与EMT相关调节因子(Twist1和Snail1)蛋白表达水平。最后,用NCI-H460源性LCSLC裸鼠移植瘤模型治疗实验评价金雀异黄素(50mg/kg体重)灌胃给药联合表达FOXM1 sh RNA腺病毒瘤内注射体内治疗NCI-H460源性LCSLC裸鼠移植瘤的有效性。结果1.Mn SOD sh RNA协作金雀异黄素(10μM)抑制NCI-H460源性LCSLC Mn SOD和Fox M1蛋白表达,肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力,CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达和逆转EMT表型作用。2.FOXM1 sh RNA协作金雀异黄素(10μM)抑制NCI-H460源性LCSLC Fox M1蛋白表达、肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力,CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达和逆转EMT表型作用,但是不影响金雀异黄素(10.0μM)对Mn SOD蛋白表达的效应。3.Mn SOD基因转导减弱金雀异黄素(10μM)抑制NCI-H460源性LCSLC Mn SOD和Fox M1蛋白表达、肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力,CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达和逆转EMT表型作用。4.FOXM1基因转导拮抗金雀异黄素(10μM)抑制NCI-H460源性LCSLC Fox M1蛋白表达、肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力,CD133、CD44和ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达和逆转EMT表型作用,但不影响金雀异黄素(10.0μM)对Mn SOD蛋白表达的抑制效应。5.FOXM1基因转导能救援Mn SOD sh RNA联合金雀异黄素(10μM)抑制NCI-H460源性LCSLC FOXM1蛋白表达,肿瘤球形成、细胞迁移和细胞侵袭能力,下调CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog和Oct4蛋白表达和逆转EMT表型作用;然而,FOXM1基因转导对Mn SOD sh RNA联合金雀异黄素(10μM)下调Mn SOD蛋白表达作用无明显影响。6.金雀异黄素和表达FOXM1 sh RNA腺病毒瘤内注射协同抑制NCI-H460源性裸鼠移植瘤生长。小结下调Mn SOD/Fox M1表达是金雀异黄素抑制NCI-H460源性LCSLC特性和EMT表型获得的作用机制之一。结论1.高表达Mn SOD导致Fox M1表达促进NCI-H460细胞获得LCSLC特性以及EMT表型。2.金雀异黄素具有抑制NCI-H460细胞、NCI-H460源性LCSLC Mn SOD/Fox M1蛋白表达和LCSLC特性及EMT表型获得作用。3.Mn SOD/Fox M1表达调控是金雀异黄素抑制NCI-H460源性LCSLC特性和EMT表型获得的作用机制之一。