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植物转基因技术中的标记基因具有潜在的危害。位点特异性重组pX6-GFP系统在去除标记基因,培育无标记转基因作物方面的应用十分广泛。该系统可受雌二醇诱导,作用稳定,抗性基因去除效果显著。本实验室从多种真菌中克隆了产油种子植物中不具有的脂肪酸脱氢酶基因,为了将无选择标记系统应用于产油种子植物转基因技术中,获得产多不饱和脂肪酸的无选择标记大豆,我们做了以下基础工作：
1.我们将pX6-GFP通过农杆菌介导的方法转入大豆子叶节中,绿色荧光蛋白表达的实验表明：在未添加雌二醇的情况下,在大豆内源雌激素大豆异黄酮的本底诱导下,该系统发生作用,在转化阳性苗的茎和叶片中出现了绿色荧光蛋白微弱的信号,通过分子检测表明在转化苗再生早期出现了抗性基因切除的现象。因而该系统并不能直接运用于大豆转基因研究中,因为抗性基因Kanr的提前敲除不利于阳性苗的筛选和培育。
2.为了获得无选择性标记的转基因大豆,我们必须对pX6-GFP载体进行改造,通过重复延伸PCR的方法获得了加入两个拷贝的RY重复序列顺式调控元件的大豆特异性启动子片段952G,通过酶切连接的方法将其与pX6-GFP中的组成型启动子G10-90实现替换,构建出新的表达载体,命名为p952G-GFP。
3.将构建好的p952G-GFP通过农杆菌介导的方法转入大豆子叶节,获得转基因植株,通过组织培养和再生系统获得了少量转基因种子。同时在再生过程中,我们检测了各个时期,各个组织绿色荧光蛋白的表达情况,实验表明在转基因大豆苗生长的早期,该转基因植株的Kanr标记基因在5μM/L β-雌二醇的诱导下并没有被切除,只在种子成熟时期在种皮和胚中发生了Kanr的切除现象,这说明新构建的载体有利于早期阳性转化苗的筛选和在阳性转化苗种子成熟时可控制的去除抗性标记,从而为在大豆种子中积累多不饱和脂肪酸奠定基础。