研究背景和目的：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一,在世界上肿瘤致死原因中排第三位。在我国原发性肝细胞癌更为常见,是我国城市位居第二的“癌症杀手”,在农村甚至排在第一位,每年大约有新发病例30.6万,每年因肝癌而死亡的人数达30万人,占世界肝癌死亡人数的50%。原发性肝癌因恶性程度高,预后差,治疗手段虽多,但效果不佳。目前治疗早期原发性肝癌的主要方法是手术切除和肝移植术,但术后复发转移率较高,两年复发率达到50%。同时,传统的放化疗对肝癌的治疗效果也不佳,因此近年来采用的分子靶向治疗方法越来越被重视。分子靶向治疗是针对可能导致细胞癌变的某个或者某些环节,从分子水平上逆转肿瘤恶性的生物学行为,从而抑制肿瘤生长的一种生物治疗模式。分子靶向治疗需要我们对原发性肝细胞癌的生物学行为不断深入了解,鉴定出与预后和临床治疗相关的靶标因子。寻找新的肝癌靶标因子,必须深入了解肝癌的致病因素、病理过程及其机制等。目前认为引起肝癌发病的因素有多种,包括病毒性肝炎、黄曲霉素、化学致癌物、寄生虫感染及遗传因素等。这些因素导致了癌基因的过度表达和／或抑癌基因的缺失或失活,最终引起肝癌的发生。然而,肝癌发生和发展的确切分子机制至今尚未完全清楚,多数学者认为肝癌的发生和发展是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂的病理学过程。癌基因是因功能获得性变异而获得激活,从而导致肿瘤的发生发展。抑癌基因的失活则源自功能失去性变异,从而提高肿瘤的易感性。相对于癌基因,抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中可能起着更大的作用。既往多数研究发现肝癌通常存在多个抑癌基因的异常,而现有发现的抑癌基因异常仅能部分解释肝癌发生发展的原因,可以推断,至今尚有未知的抑癌基因存在。因此,新抑癌基因的发现及其功能研究已成为肿瘤研究的热点,这不仅能进一步揭示肝癌的发病机制,而且也可为分子靶向治疗提供新的靶标因子,有助于发现新的治疗方法。ZFYVE26是近年来新发现的广泛表达的带有FYVE结构域的锌指蛋白,其基因定位于染色体14q23.3-q24.2的2.64Mb区间上。由于在一种复杂型常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫(HSP或SPG)的疾病中经常可以发现有ZFYVE26的突变,因此按SPG疾病相关蛋白的命名习惯,也将其命名为Spastizin。研究发现,ZFYVE26在细胞信号传导、膜转运、细胞骨架功能和凋亡中扮演了重要的角色。目前对ZFYVE26的研究主要是在调节胞质分裂方面,它的编码蛋白可定位于中间体,从而参与胞质分裂的调控。另外,研究也发现在胚胎中ZFYVE26基因广泛表达,并且较成年组织明显上调,由此推测ZFYVE26可能也参与了胚胎发育。Sagona等的研究发现,ZFYVE26的突变或缺失可影响其与抑癌基因Beclin1的作用,从而干扰正常的细胞分裂,因此认为这是Beclin1抑癌功能新的作用机制。而且和抑癌基因Beclin1一样,ZFYVE26基因在乳腺癌中明确下调,并且与乳腺癌的恶性程度呈负相关。目前ZFYVE26基因在肿瘤的发生发展中确切的作用机制尚不清楚,但现有资料表明ZFYVE26基因的突变或下调在肿瘤的发病机制中可能发挥重要作用。胞质分裂的失败将促进肿瘤的发生,而ZFYVE26恰好就在这个过程中扮演很重要的角色,它有可能就是作用广泛的抑癌基因。因此,推钡ZFYVE26在肝细胞癌发生发展过程中可能也发挥重要作用。目前关于ZFYVE26在原发性肝细胞癌中表达水平情况的研究尚少见报道。本研究旨在通过揭示ZFYVE26基因下调或失活在原发性肝细胞癌发病中的作用及可能的机制,为寻找新的治疗策略提供理论基础。目的：探讨ZFYVE26在肝癌组织以及人肝癌细胞株中的表达情况,了解其在肝癌组织中的表达与细胞增殖指标Ki-67之间的关系,为进一步阐明ZFYVE26在肝癌发生发展中的作用提供依据。方法：1、运用实时荧光定量PCR方法检测正常肝脏细胞株L-02和肝癌细胞株HepG2、MHCC-LM3中ZFYVE26mRNA的表达情况。2、采用实时荧光定量PCR和、Vestern Blot方法检钡JZFYVE26在7例人肝癌组织及其癌旁组织中的表达情况。3、利用免疫组织化学EnVision法检测了ZFYVE26和Ki-67在45例原发性肝细胞癌及其对应癌旁组织,以及8例正常肝脏组织(肝血管瘤旁组织)中的表达情况。4、统计处理采用SPSS13.0统计软件,各分组计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,细胞株实时荧光定量PCR结果采用单因素方差分析,多重比较采用LSD检验；而肝癌及其癌旁组织Western blot和RT-PCR结果采用配对t检验；免疫组化结果采用χ2检验,并采用Spearman相关性分析分析ZFYVE26的表达与细胞增殖指数Ki-67之间的关系；以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、正常肝脏细胞株L-02、肝癌细胞株HepG2及MHCC-LM3中ZFYVE26mRNA的相对表达水平分别为(1.0195+0.2371)、(0.4455±0.0753)和(0.1230±0.0573)。ZFYVE26mRNA在肝癌细胞株MHCC-LM3、HepG2中的表达量较正常肝脏细胞系L-02中的表达量明显下调(t=0.574,P<0.05；t=0.896,P<0.05);ZFYVE26mRNA在高转移潜能的肝癌细胞株MHCC-LM3中的表达量显著低于低转移潜能的肝癌细胞株HepG2(t=0.322,P<0.05)。2、在7例原发性肝细胞癌组织及其相应的癌旁组织中ZFYVE26mRNA的相对表达量分别为(0.574±0.348)和(0.956±0.316),而其编码的蛋白相对表达量分别为(0.081±0.126)和(0.203±0.169),肝癌组织中的ZFYVE26mRNA及其所编码的蛋白表达量均显著低于其在癌旁组织中的表达,差异均有统计学意义(t=3.042,P<0.05；t=3.157,P<0.05)。3、45例原发性肝细胞癌组织中,ZFYVE26蛋白阳性例数为24例,阳性表达率为53.33%；而相应癌旁组织中有36例表达阳性,阳性表达率为80.00%；8例肝血管瘤旁正常对照组织中均可见ZFYVE26蛋白的表达,阳性表达率100.00%。肝癌组中ZFYVE26的阳性表达率明显低于癌旁组及正常对照组,差异均有统计学意义(χ2=7.200,P<0.0167；χ2=6.183,P<0.0167)；癌旁组与正常对照组中ZFYVE26蛋白的表达率无统计学差异(χ2=1.927,P>0.0167)。4、45例肝癌组织中Ki-67阳性数为31例,阳性表达率为68.89%；相应癌旁肝硬化组织中为10例,阳性表达率为24.39%；而肝血管瘤旁正常对照组中为0例,Ki-67的表达均为阴性。肝癌组中Ki-67阳性表达率明显高于癌旁组及正常对照组,差异均有统计学意义(χ2=6.480,P<0.0167；χ2=13.277,P<0.0167);癌旁组与正常对照组中Ki-67蛋白的表达率无统计学差异(χ2=5.265,P>0.0167)。5、肝癌组织中,ZFYVE26蛋白阳性的组织中,Ki-67阳性的例数为13,阴性例数为11；而ZFYVE26蛋白阴性的组织中,Ki-67阳性的例数为18,阴性例数为3。经Spearman相关分析,rs=-0.416,P<0.05,提示ZFYVE26和Ki-67在肝癌组织中的表达呈明显负相关关系。结论：1、在肝癌细胞株中ZFYVE26mRNA的表达比正常肝脏细胞株表达明显下调,以高转移潜能的肝癌细胞株MHCC-LM3下调最为明显；在7例肝癌组织中ZFYVE26mRNA和蛋白的表达均较其癌旁组织显著下降。采用免疫组化检测45例原发性肝癌中ZFYVE26蛋白的表达,同样发现癌组织中ZFYVE26蛋白也明显下调。提示ZFYVE26与肝癌的发生发展有关。2、通过对ZFYVE26蛋白和Ki-67蛋白在原发性肝细胞癌中表达的相关分析,发现两者呈负相关,即随着肝癌组织中Ki-67表达率的增高,ZFYVE26呈低表达趋势。提示ZFYVE26反向调节原发性肝细胞癌的增殖,与恶性程度和侵袭等病理学特性呈负相关。目的：进一步验证ZFYVE26在肝癌发生发展过程中的作用,我们在该部分实验中采取了RNAi的方法对ZFYVE26的功能进行研究,观察对其干扰后是否影响肝癌细胞株HepG2的增殖和侵袭转移能力,为进一步研究肝癌发生发展机制提供新的思路。方法：1、从NCBI中查找人ZFYVE26的mRNA序列,利用生物信息学对序列进行分析。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具,选择3段针对ZFYVE26的小干扰RNA (siRNA),分别是siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3,同时设计无干扰的siRNA序列(siRNA-NC)。利用脂质体将它们转染人肝癌细胞株HepG2,提取转染后各组细胞总RNA,采用荧光定量PCR法分析各组细胞ZFYVE26mRNA表达的变化情况,筛选出靶向基因最有效的siRNA。2、根据筛选有效的siRNA序列设计短发夹RNA (shRNA)寡核苷酸链,构建pGPU6/GFP/Neo重组质粒表达载体。利用脂质体将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,48小时和60小时后分别提取各组细胞总RNA和蛋白,采用荧光定量PCR和Western blot方法检测各组细胞中ZFYVE26的变化情况。3、shRNA载体转染HepG2后,采用CCK8法检测转染24小时、48小时和72小时ZFYVE26表达改变后肝癌细胞株HepG2的增殖情况。4、转染shRNA载体48小时和60小时后,利用Transwell法分别检测HepG2细胞的转移和侵袭能力的变化。5、统计处理采用SPSS13.0统计软件,各分组计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,实时荧光定量PCR、Western blot和transwell等结果采用单因素方差分析,多重比较采用LSD检验；CCK-8结果采用析因分析后固定时间水平进行单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、荧光定量PCR结果显示siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3对HepG2中ZFYVE26均有一定抑制作用,与脂质体组(siRNA-0)相比差异均有统计学意义(t=0.534,P<0.05；t=0.800,P<0.05；t=0.701,P<0.05),其中siRNA-2抑制效率最高(79.42%)；而siRNA-0组与siRNA-NC相比,差异无统计学意义(t=0.098,P>0.05)。2、利用针对siRNA-2合成的shRNA与质粒pGPU6/GFP/Neo构建表达载体pGPU6/GFP/Neo-ZFYVE26(shRNA-1),经酶切鉴定和测序结果均表明构建成功。实时荧光定量PCR和western blot方法检测结果表明,shRNA-1组中ZFYVE26的表达受到明显的抑制,与shRNA-0组相比均有显著性差异(t=0.768,P<0.05；t=0.296,P<0.05)；而阴性对照组(shRNA-NC)与shRNA-0差异无统计学意义(t=0.052,P>0.05；t=-0.0065,P>0.05)。3、利用CCK-8法分别对不同时间点shRNA-0、shRNA-NC、shRNA-1三组细胞进行检测,析因分析时间和处理因素,发现两者有交互作用(F=11.047,P<0.05)。24小时三组细胞450nnm处OD值差异无统计学意义(F=1.662,P>0.05)；48小时和72小时shRNA-0组与shRNA-NC组OD值无显著性差异(t=0.009,P>0.05;t=-0.025,P>0.05)；而靶向干扰ZFYVE26表达48小时和72小时后OD值显著高于shRNA-0组(t=-0.0548,P<0.05；t=-0.153,P<0.05)和shRNA-NC组(t=-0.064,P<0.05；t=-0.128,P<0.05)。4、利用transwell法检测靶向干扰ZFYVE26后HepG2细胞转移与侵袭能力的变化,结果发现接种于不铺基质胶小室的shRNA-1组细胞穿膜细胞数较shRNA-0组和shRNA-NC组增加,差异均有统计学意义(t=12.250,P<0.05；t=16.000,P<0.05),提示shRNA-1组细胞转移能力明显增强；接种于铺有基质胶小室的shRNA-1组细胞穿膜细胞数较shRNA-0组和shRNA-NC组也明显增加,差异有统计学意义(t=26.500,P<0.05；t=22.500,P<0.05),提示shRNA-1组细胞侵袭能力也明显增强。结论：成功构建了人ZFYVE26特异性shRNA干扰质粒,为研究ZFYVE26基因在肝癌发生机制提供了实验基础。利用构建成功的shRNA载体靶向干扰ZFYVE26后,发现HepG2细胞增殖、转移、侵袭能力明显增强,提示ZFYVE26参与了肝癌的发展过程。我们的研究仅在ZFYVE26在肝癌中的表达情况进行初步研究,本研究仍可以进一步深入和全面的进行。