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第一部分新生大鼠嗅鞘细胞的分离、培养和纯化研究目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的分离、培养和纯化方法,为后期的基因修饰嗅鞘细胞修复视神经损伤研究奠定基础。方法取2d内的新生大鼠嗅球组织,在解剖显微镜下分离取材,原代培养嗅鞘细胞,运用差速贴壁法和差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法两种方法进行纯化,在倒置显微镜下观察不同培养时间嗅鞘细胞的形态、数量和NGFRp75抗体免疫荧光结果,统计嗅鞘细胞的纯度。结果嗅鞘细胞的纯度分别是差速贴壁组平均为60.41%±4.32%,差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法组平均为84.98%±4.03%。两组数据用t检验进行统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论取材于新生大鼠,显微镜下分离脑膜,差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法纯化,都是良好的嗅鞘细胞培养方法。第二部分大鼠NEP1-40基因的扩增及重组慢病毒载体的构建目的构建携带大鼠NEP1-40目的基因的重组慢病毒,并检测其体外表达目的基因的能力。方法PCR扩增出TAT/NEP1-40编码片段,定向克隆入pLV.Des2d.P/puro载体,Lipofectamine2000转染293FT细胞包装携带NEP1-40目的基因的重组慢病毒,测序证实为TAT/NEP1-40后大量扩增,以基因转移单位(GTU)法测定病毒滴度,运用PCR和western blot分别检测NEP1-40在293FT细胞中转录水平和蛋白水平的基因表达。结果成功构建携带大鼠NEP1-40目的基因的重组慢病毒,并证实其在293FT细胞中可表达NEP1-40。结论携带大鼠NEP1-40基因的重组慢病毒可在体外表达其目的基因,为研究NEP1-40在视神经损伤恢复中的作用奠定基础。第三部分慢病毒介导的NEP1-40基因在体外嗅鞘细胞中的表达目的研究慢病毒介导的NEP1-40基因在体外嗅鞘细胞中的表达,并初步观察转染了NEP1-40基因的嗅鞘细胞对视网膜节细胞的作用。方法用NEP1-40慢病毒载体转染体外原代培养嗅鞘细胞,应用PCR及ELISA检测NEP1-40基因在嗅鞘细胞中转录水平和蛋白水平的表达,并将转基因嗅鞘细胞与视网膜神经节细胞共培养,观察节细胞轴突的生长情况。结果NEP1-40慢病毒载体转染体外原代培养嗅鞘细胞后经过PCR和ELISA检测,在转录水平和蛋白表达水平证实NEP1-40基因均有表达,转基因嗅鞘细胞与视网膜神经节细胞共培养时观察到节细胞生长状况良好。结论NEP1-40重组慢病毒载体可以转染体外原代培养嗅鞘细胞,并能在细胞外表达其目的基因,促进视网膜神经节细胞生长,为后期动物实验奠定基础。