纤维小体是附着在部分厌氧微生物细胞壁外的一种天然多酶复合体,可以高效催化降解木质纤维素,其结构稳定性强,组装灵活。目前依靠纤维小体在多种微生物表面实现了多酶系统的高效聚合,在提高多酶协同效率方面具有较大的应用潜力,但其在细胞内始终无法实现自组装。本研究选定纤维小体为胞内自组装体系的基本模型,并选择其关键元件（对接蛋白及粘连蛋白）作为主要研究对象,以大肠杆菌为平台,着重对其自组装机制进行探索与分析,并采用理性设计方法对对接蛋白进行定向改造,再结合实验寻找适合在胞内组装的突变方向,并构建适用于高通量筛选的流式筛选体系,为以纤维小体为模型的胞内自组装体系的成功构建夯实基础。研究结果分为以下三个方面:（1）选择已解析出其晶体结构的I型对接蛋白Doc A和粘连蛋白Coh作为研究对象,下载其三维结构并用Py MOL等软件进行分析,发现对接蛋白有2个钙离子结合位点。后将两蛋白分别在大肠杆菌中进行表达,再利用分子互作仪对两蛋白的结合机制进行初步探究。研究发现,对接蛋白和粘连蛋白的稳定结合需要5×10^-4 mol/L左右的钙离子浓度的参与,当钙离子浓度在0～5×10^-3 mol/L时,钙离子浓度越高,结合能力就越强,结合就越稳定,其中以钙离子浓度在5×10^-4～10^-2 mol/L内的变化对结合能力的影响最为显著,但当浓度低于10^-4 mol/L时,两者的结合能力则几乎接近钙离子浓度在0 mol/L时的结合能力,表明两原始蛋白不具备在胞内装配的能力。（2）把可操作性更高的蛋白Doc A作为主要改造对象,以钙离子4?范围内的氨基酸作为关键点进行定向改造,先利用Gromacs等软件对14种单位点突变体与蛋白Coh的对接进行分析,发现突变体D39R的RMSD值与原蛋白相差最小为0.174,表明突变可能提高Loop D39-E55的刚性;后利用实验手段对选取的突变体进行与蛋白Coh的结合能力测试,筛选出对钙离子依赖较低的突变体D39R,发现其在钙离子浓度为5×10^-4 mol/L时的结合能力最强,是原蛋白的6.71倍,低钙离子浓度下仍具有一定结合能力。而后又进行了4种双位点突变研究,借助Rosetta@home计算网站分析与实验探究,发现最优双位点突变体36864在钙离子浓度为5×10^-4 mol/L时的结合能力最强,是原蛋白的5.88倍,钙离子浓度为0 mol/L时的结合能力是突变体D39R的1.19倍,在低钙离子浓度下仍有一定结合能力。通过比较发现双位点突变蛋白在胞内组装的效果明显优于单位点突变蛋白,也初步推断2个钙离子结合位点对两蛋白的稳定结合均具有影响作用。（3）为提高对接蛋白随机突变体的筛选效率,在分析荧光蛋白种类的连接方式对突变体对接和流式细胞仪筛选的影响后,初步构建基于荧光蛋白的筛选系统。通过融合蛋白表达技术,分别构建“冰核蛋白INP-绿色荧光蛋白EGFP-蛋白Doc A”、“蓝色荧光蛋白EBFP-蛋白Coh”、“红色荧光蛋白m Cherry-蛋白Coh”、“冰核蛋白INP-蛋白Doc A”和“绿色荧光蛋白EGFP-蛋白Coh”融合蛋白,并在大肠杆菌中分别进行表达和荧光分析。结果显示绿色荧光蛋白EGFP与Doc A和Coh的融合荧光信号较强,表明EGFP与蛋白Doc A和Coh都具有较高的兼容性。为后期使用流式细胞分选仪进行高效筛选打下基础。