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一直以来不育不孕都是一个重大的全球性健康问题。全球范围内的育龄夫妇约有10%-15%存在不同程度的生育问题,我国不孕不育的发病率也超过了10%,男方因素在其中约占30%。研究显示,半个多世纪以来人类精液质量显著下降,其中精子生成障碍是男性不育最常见的病因,也是我国成年男性面临的最主要生殖健康问题,而非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是精子生成障碍中最为严重的表现形式。常见的引起非梗阻性无精子症的遗传因素包括:Y染色体微缺失、常染色体结构异常、X染色体连锁异常、基因突变等。其中,Y染色体微缺失是引起精子生成障碍常见的遗传因素,占遗传因素所致精子生成障碍的6%-18%;性染色体数目异常,如Klinefelter’s综合征也是引起精子生成障碍的常见原因。近年来,越来越多的单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant,SNV)被发现与精子生成障碍相关,课题组前期通过全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)也发现了一些与NOA显著相关的易感基因/位点。尽管如此,上述原因也只能解释大约20%的由遗传因素导致的非梗阻性无精子症病例,仍然有接近80%的非梗阻性无精子症病例是不能通过以上遗传因素所解释的,而这部分病例我们称之为“原发性(idiopathic)”非梗阻性无精子症。虽然,GWAS在探索复杂疾病遗传易感性方面具有独特优势,但是在探索低频变异和罕见变异时GWAS就显得检验能力不足。而高通量测序在检测低频变异和罕见变异方面具有独特优势,因此本研究通过高通量测序技术对NOA患者DNA样本进行外显子组测序探索SNV在精子发生过程中的作用。同时,借助CRISPR/Cas9技术构建基因编辑小鼠模型对致病性SNV进行功能验证和机制探讨。新发现的致病基因,将帮助我们更加深入了解精子生成的遗传学机制,同时也为不育症的分子诊断和治疗提供新的途径。第一部分基于非梗阻性无精子症(NOA)核心家系全外显子组遗传变异筛选及机制研究非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是精子生成障碍中最为严重的一种表现形式,约占成年男性的1%。引起精子生成障碍的因素有很多,常见的因素包括环境化学污染物、遗传因子改变、表观遗传修饰异常等因素,而其中大约有30%的患者是由于遗传学的异常所引起的。既往我们对于遗传相关疾病致病基因的筛选主要依赖于家系的连锁分析,但其无法对致病位点进行精确定位,从而导致一些可能的致病位点被忽略,而核心家系结合高通量测序可以很好的弥补连锁分析的不足。因此,我们基于NOA核心家系,通过对其进行全外显子组测序,结合遗传模式,筛选与NOA相关的罕见遗传变异及de novo突变,进而通过CRISPR/Cas9系统,构建基因点突变小鼠模型,揭示其在NOA发生过程中的作用及机制。首先,通过对16个NOA核心家系进行全外显子组测序,参考SIFT,Mutation Taster,Polyphen-2以及Ex AC,1000 Genomes,HGMD等正常人群/疾病数据库对突变位点进行致病性预测。结合遗传模式,共有2个罕见遗传变异位点COG5chr7:106924058 G>A和NLRP14 chr11:7091668 T>G可能与NOA相关。进而,我们通过小鼠生殖细胞功能实验,发现Cog5敲低之后可以影响生殖细胞的周期和增殖。NLRP14已有文献报道其与NOA相关且在睾丸中较高表达。因此,我们未对其进行体外功能验证。随后,我们通过CRISPR/Cas9技术构建了2个位点的点突变小鼠模型,进一步探索其在精子生成过程中的可能作用机制。第二部分非梗阻性无精子症(NOA)X染色体遗传变异筛选与机制研究精子发生是一个连续的细胞分裂及分化过程。传统观念认为,在此复杂过程中,Y染色体起到举足轻重的作用。近年研究发现,许多X染色体基因在女性中并不发挥作用,但对维持正常男性生殖功能中具有重要意义,并在某种程度上可影响男性的性别形成。同时,由于X染色体在男性中以半合子(hemizygous)状态存在,所以X染色体连锁基因通常承受着特别的进化压力,X染色体连锁基因一旦发生突变不会像位于常染色体上的基因那样可通过一个正常的等位基因代偿,而降低疾病的发生。因此,X连锁遗传病(X-linked inheritance disease)在男性中具有较高的发病率。实验室前期已完成96例NOA病例和96例对照的X染色体外显子组测序工作,并对候选位点进行了两阶段独立人群验证,结合生物信息学分析和SSC功能实验验证,共有2条基因纳入后续整体动物水平研究。借助CRISPR/Cas9技术构建基因敲除小鼠模型对候选基因进行动物水平功能验证和机制探讨。结果显示,Bcorl1敲除之后小鼠不育,CASA分析发现精子数量以及精子活力显著下降。通过对小鼠睾丸切片PAS和HE染色分析,我们发现减数分裂各期精母细胞都呈现减少的趋势。精子透射电子显微镜结果显示,精子线粒体出现结构异常。由此,我们推测Bcorl1可能参与精子发生以及精子运动过程进而影响男性生育。该研究的实施将为NOA患者的发病机制、临床诊断和治疗提供新的思路和策略。