【摘 要】
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玉米（Zea mays L）是我国主要的粮食作物,也是种植面积最广作物之一,在我国粮食安全中占据着重要地位。而玉米灰斑病发生和流行限制了我国玉米的生产。目前,玉米与灰斑病的互作机制还尚未明晰,玉米抗灰斑病基因还需要继续挖掘鉴定。鉴于此,本研究选取高抗灰斑病自交系T32和高感灰斑病自交系交51为试验材料,通过高通量测序技术,开展对抗感材料接菌与未接菌的转录组分析,系统性地研究抗感材料在受到玉米灰斑病
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玉米（Zea mays L）是我国主要的粮食作物,也是种植面积最广作物之一,在我国粮食安全中占据着重要地位。而玉米灰斑病发生和流行限制了我国玉米的生产。目前,玉米与灰斑病的互作机制还尚未明晰,玉米抗灰斑病基因还需要继续挖掘鉴定。鉴于此,本研究选取高抗灰斑病自交系T32和高感灰斑病自交系交51为试验材料,通过高通量测序技术,开展对抗感材料接菌与未接菌的转录组分析,系统性地研究抗感材料在受到玉米灰斑病病原菌胁迫前后差异表达基因（DEGs）及其参与的相关生物过程和代谢途径,并结合课题组前期精细定位结果,筛选和克隆重要的抗玉米灰斑病候选基因,对候选基因进行表达分析、功能位点鉴定和生物信息学分析,以期通过以上研究为玉米抗灰斑病分子标记辅助育种和遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1、以自交系T32和交51为试验材料进行田间自然接菌和不接菌处理,设置三个生物学重复,于抽雄期进行穗位叶取样及测序,共建立了12个c DNA文库,获得533.17 Million Clean Reads。抗性材料接菌与对照比较,上调基因数为3187个,下调基因数为1658个。感病材料接菌与对照比较,上调基因为2923个,下调基因数为1608个。GO功能注释发现差异表达基因主要在代谢过程、细胞过程、催化活性、生物调节和刺激反应等生物过程中。Kegg分析显示差异表达基因主要富集在次生代谢物的生物合成、代谢途径、苯丙烷生物合成、氨基酸的生物合成、碳代谢、不同环境中的微生物代谢、抗生素的生物合成、植物-病原体的相互作用等途径中。通过对植物激素信号转导和植物-病原菌互作通路进一步分析发现,有多个与脱落酸、茉莉酸、生长素和细胞分裂素这4种激素信号通路相关的差异表达基因和多个参与植物-病原菌互作反应相关蛋白基因均在抗感材料中的表达模式上存在一定的差异,推测这些基因可能参与玉米响应灰斑病的相关调控。2、课题组前期已将抗灰斑病主效QTL位点q GLS8定位于玉米第八染色体约124 kb的物理区间内,利用转录组测序数据分析精细定位区间内7个基因的表达模式,发现两个差异表达基因,其中Zm00001d008808在T32中接菌后表达量升高了4.21倍,表达量差异倍数为1.579。Zm00001d008812在T32中接菌后表达量下降了7倍,表达量差异倍数为3.3。其余基因不表达或者表达量极低,结合基因注释将基因Zm00001d008808预测为抗玉米灰斑病候选基因。3、通过克隆得出Zm00001d008808基因序列全长共有2235bp,抗感材料基因同源性为99.6%,共有7个碱基发生突变。氨基酸序列预测发现该基因共编码375个氨基酸,氨基酸同源性为99.2%,发现了3个氨基酸突变位点,第一个在第68位处,T32中为亮氨酸（L）交51中为脯氨酸（P）,第二个在第250位处,T32中为苏氨酸（T）交51中为丙氨酸（A）,第三个在362位处,T32中为脯氨酸（P）,交51中为丝氨酸（S）。4、通过对Zm00001d008808基因在不同组织中的表达情况进行荧光定量分析,得出候选基因在接菌后的抗性材料叶片中被大量诱导,其次是雄穗,其中抗性材料叶片相对表达量是感病材料叶片相对表达量的3.3倍,呈现极显著差异。通过亚细胞定位预测显示该基因主要位于细胞核和叶绿体基质中;理化性质预测表明该基因属于不稳定蛋白,等电点（p I）值为10.12,蛋白质亲水性平均值为-0.343。5、在6份对玉米灰斑病表现感病的材料中进行候选基因克隆及测序,并通过氨基酸多序列比对发现两个重要功能位点,第一个在第68位处,T32为亮氨酸（L）,另外7份感病材料中全为脯氨酸（P）,第二个在第362位处,T32为脯氨酸（P）,其它7份感病材料中全为丝氨酸（S）,由此可推测,这两处氨基酸突变位点极有可能是引起Zm00001d008808基因产生抗性功能的重要位点。
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