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CRISPR/Cas9技术是目前应用最广泛的基因编辑技术,其安全性评估对于该技术未来在动物育种和临床应用具有重要意义。本研究利用课题组前期获得的MSTN和FGF5基因编辑的陕北白绒山羊本交获得其F1群体,通过对基因编辑绒山羊及其后代(F1代)进行全基因组重测序,严格筛选出新发突变,并结合脱靶位点预测和新发突变的分布判断CRISPR/Cas9技术导致的真实变异情况,这些变异包括:单核苷酸变异(Single nucleotide variants,SNVs)、插入或缺失(Insertion-deletion,Indels)和结构变异(Structure variants,SVs)。对MSTN编辑个体的肌肉组织和FGF5编辑个体的皮肤组织及未编辑个体的皮肤和肌肉组织进行全转录组测序,检测其在转录水平的变化;利用免疫荧光和Western Blot量化基因编辑羊p53蛋白的变化,分析CRISPR/Cas9系统在编辑过程中的潜在健康风险。主要结果如下:1、成功获得F1代基因编辑绒山羊。通过本交获得了MSTN和FGF5基因编辑陕北白绒山羊后代;利用Sanger测序检测F1代的基因型,除F1代#P59个体外,其他个体(#P6、#P97、#P8、#P9)均检测到了与父母代相同的编辑位点,证明经基因编辑的位点可传至下一代。2、家系重测序及变异检测。利用全基因组重测序技术对来自四个家系的11个个体进行测序,并基于全基因组SNVs检测亲缘关系,确保家系信息与繁育过程的亲缘关系记录一致。随后,经严格过滤获得了F1代新生SNV,并利用Sanger测序验证新生SNV准确性达到70%,且这些SNVs在基因组上均未出现在编辑位点附近;四个家系中(有两个是双胞胎)共检测到19个新生Indels(10个插入,9个缺失),平均每个后代3.8个;四个家系中共检测到4个拷贝数变异(2个复制,2个缺失),平均每个后代1.5个;这些均与正常家系每代的变异数目相同。3、基因编辑羊全基因组脱靶突变检测。利用Cas-OT和Cas-OFFinder软件预测MSTN和FGF5基因的4个sgRNA对应的脱靶位点,取交集后在4个sgRNA中分别获得340、483、470、442个预测的脱靶位点,编辑个体中新生SNV均未出现在预测的脱靶区域。表明编辑没有引起SNV相关的脱靶突变。4、F1代羊组织表达谱分析。MSTN编辑个体的肌肉组织与未编辑个体比较,共检测到43个差异表达基因,其中23个上调、20个下调,差异基因功能注释显示其主要与肌纤维发育相关;FGF5编辑个体皮肤组织和未编辑个体相比,共检测到140个差异基因,其中74个上调、66个下调,功能注释这些差异基因表明主要与皮肤、毛囊发育相关。5、F1代羊组织中p53蛋白表达量变化。p53表达量的变化可能与肿瘤形成有关,因此,本研究利用免疫荧光和Western blot技术检测MSTN编辑个体肌肉组织中p53基因表达的变化,结果表明编辑个体和未编辑个体间无显著差异。全转录组测序分析显示p53与细胞程序性凋亡相关基因的mRNA表达量在编辑个体和未编辑个体间无显著变化。表明CRISPR/Cas9技术在基因编辑的陕北白绒山羊中未引入潜在风险。综上所述,在基因编辑陕北白绒山羊基因组上未检测到双链断裂诱发的SNVs,同时F1的突变率几乎和正常家系;mRNA差异表达结果表明MSTN编辑个体的肌肉组织的差异基因主要与肌纤维发育相关,FGF5编辑个体的皮肤组织的差异基因主要与皮肤、毛囊发育相关;蛋白结果显示CRISPR/Cas9未诱导p53蛋白差异表达。本研究初步证明了基因编辑技术的可靠性,为CRISPR/Cas9技术在动物育种和生物医学中的应用提供了参考。