毕赤酵母(Pichia pastoris)具有较强的胞外表达能力,可以在由甲醇和无机盐组成的简单培养基中进行高密度发酵,因而被广泛应用于各种重组蛋白的工业化生产。生产过程中对重组菌株的改造主要通过提高外源基因在宿主体内的拷贝数,以及共表达分子伴侣来实现。鉴于酵母细胞提供的有限种类的筛选压力使重组质粒不能反复整合到基因组上,因此研发出一种利用单一抗性即可多次编辑基因组的表达载体具有重要意义。本研究建立了一种可以快速获得高拷贝无抗性酵母表达平台的方法。其原理在于含有多拷贝外源基因的表达质粒整合到酵母基因组上后,质粒上携带的抗性基因可以被甲醇诱导的Cre重组酶删除。产生的无抗性酵母转化子可以接受下一轮表达质粒的整合,并最终实现利用单一抗性提高外源基因的拷贝数。构建该质粒时发现,甲醇诱导的AOX启动子可以被大肠杆菌识别并起始Cre重组酶的表达,使质粒内部发生重组,Cre表达元件被删除。本研究将lacO基因插入到AOX启动子和CRE基因之间,控制了 Cre重组酶在大肠杆菌中的泄漏表达,从而完成了新型毕赤酵母表达载体pMC-GAPα和pMC-AOXα的构建。大肠杆菌的植酸酶AppA是一种耐热植酸酶,在饲料行业中具有潜在产业化前景,但低表达量限制了该酶的工业化生产。利用构建的表达载体,以appA为报告基因,检测pMC系列质粒对AppA在毕赤酵母中表达的改善效果。检测结果显示目的蛋白的产量对基因的剂量有依赖性,呈现出正相关性,该结论对于GAP启动子和AOX启动子都适用。GAP组12拷贝转化子与1拷贝转化子相比,酶活产量提高2.90倍,AOX组12拷贝转化子的酶活与对照相比则提高4.45倍,达到了目前产业化表达水平。当插入的外源基因拷贝数超过一定界限时,由于宿主体内的分子伴侣有限,相当部分的新生肽链不能正确折叠从而被靶向至内质网相关降解途径降解(ERAD),因此出现了基因拷贝数升高,酶活反而下降的现象。横向比较相同基因剂量条件下GAP组和AOX组启动子的表达水平,发现AOX组的1、2、4个拷贝的表达水平均低于GAP组相应拷贝数的表达水平,但8拷贝和12拷贝的表达水平高于GAP组。此结果证实单拷贝条件下GAP启动子有较高的转录启始效率,同时,高拷贝水平上GAP组较低的酶活水平,提示着GAP和AOX启动子在“启动子的识别与调控”方面存在着差异。以上研█究说明pMC系列表达质粒可以有效提高外源基因的基因剂量,进而提高目的蛋白的表达量。酵母是工业生产中常用的表达宿主,在培养基中使用廉价的碳源可以有效控制生产成本。糖蜜是以蔗糖为主要成分的工业副产物,可以作为廉价碳源添加到酵母培养基中。由于毕赤酵母无法直接利用蔗糖,本研究将来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2插入到GAP为启动子的多拷贝转化子中,以期使其获得利用蔗糖的能力,在廉价的培养基中高效表达目的蛋白。结果显示,SUC2导入到毕赤酵母转化子后虽使其获得了以蔗糖为碳源进行生长的能力,但植酸酶的酶活产量降低了 41.3%,推测其原因为α-Factor和SUC2的信号肽发生干扰。在实现酵母重组表达的工业用酶中,关于壳聚糖酶和几丁质酶的报导也有很多。这两种酶在植物真菌性病害的生物防治中都具有一定的应用潜力。Aquabacterium sp.A7-Y是本实验室分离的一株新菌,其基因组上存在9个几丁质降解相关的基因序列。本研究首先在大肠杆菌中重组表达了以上糖苷水解酶,其中两个壳聚糖酶检测到了相关活性,将其分别命名为ChoA和ChoB。ChoA的原始核苷酸序列全长1404 bp,编码467个氨基酸,预测蛋白大小为50.7kDa,其中前23个氨基酸是信号肽序列。ChoA与来源于Thermobifida fusca的内切葡聚糖酶的相似性为61%。ChoB的原始核酸序列全长1551 bp,编码516个氨基酸,预测蛋白大小为57.68 kDa,不含信号肽序列。ChoB与来源于Streptomyces sp.Sirexaa-e的壳聚糖酶的相似性为73%。将去掉信号肽的ChoA和ChoB在E.coli BL21(DE3)中进行重组表达,利用Ni2+-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白ChoB;通过在ChoA的N端加上6个赖氨酸,提高了其表达量,并获得了 ChoA的纯化蛋白。对二者进行相关酶学特性的分析,结果显示ChoA的比酶活为18.53 U·mg-1,ChoB的比酶活为13.18 U·mg-1;二者的最适反应pH均为5.0,最适反应温度都是40℃。相比ChoB而言,ChoA的热稳定性更高,对DMF和SDS以外的供试化学试剂更不敏感。在底物特异性和水解产物特异性方面,ChoA不仅可以水解壳聚糖,还可以水解羧甲基纤维素钠,ChoB只能专一性水解壳聚糖。ChoA水解壳聚糖的终产物为三、四、五、六糖,而ChoB的水解终产物为壳二糖和壳三糖。真菌对峙实验结果表明ChoB不能显著抑制供试的两种植物病原真菌的生长,而ChoA可对黄瓜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum sp.cucmrium)产生一定的抑制效果。由于壳聚糖酶具有一定的应用价值,而之前的实验证实pMC系列表达载体可以提高目的蛋白的表达量,故将choA和choB克隆到pMC载体并进行酵母重组表达,以期得到大量的蛋白来满足后续研究的需要。酶活测量结果显示,choA转化子的发酵液上清中的酶活产量为0.178 U·mL-1,而choB转化子的发酵液上清中检测不到相应活性。构建choA的多拷贝转化子以提高目的蛋白的产量,结果显示当choA的拷贝数为4个时其酶活产量最高(达到0.324 U·mL-1),是1拷贝转化子的1.82倍。将来源于 P.pastoris 的 PDI、ERO1、BIP、HAC1、SSA1 基因,和来源于S.cerevisiae 的 YDJ1、SSA4、SSE1、SSO1、SSO2基因与choA共表达(这10个分子伴侣均被报导可以提高目的蛋白的产量),结果显示 PDI、ERO1、HAC1、YJD1、SSA4、SSE1、SSO2 对 choA的表达均具有不同程度的促进作用,对GAP-1-choA(含有1个拷贝的转化子)分别提高了 31%、16%、17%、21%、15%、24%和 11%,对 GAP-choA(含有 4 个拷贝的转化子)则分别提高了 80%、30%、38%、31%、21%、36%和21%。将除了HAC1以外的6个分子伴侣陆续构建到一个质粒上,与choA共表达,并且提高choA的拷贝数,发现优化后ChoA的表达量为2.319 U·mL-1,是未优化前的13.03倍,提示“复合型”优化策略可以更高效的提高目的蛋白的表达量。综合以上研究,密码子优化、不同的启动子与信号肽的组合、构建多拷贝宿主和共表达分子伴侣等措施的综合使用,可以有效提高目的蛋白的表达量。而本研究获得的pMC系列表达载体可以实现无抗生素抗性的高拷贝酵母转化子,以及无抗生素抗性的共表达分子伴侣的酵母转化子的快速构建,因而具有广泛的应用前景。