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本研究以番茄为实验材料,探究提高CRISPR/Cas9系统编辑效率的方法,并总结出一套操作简便,高效快捷的操作系统。CRISPR/Cas9系统由sgRNA和Cas9蛋白两个元件构成,系统构建十分简便,同时Cas9对靶位点的剪切十分精准,因此在基因编辑领域备受青睐。然而在实际的应用中,CRISPR/Cas9系统的编辑效率并不理想。目前对植物中CRISPR/Cas9系统的应用主要限制在编辑效率不高,以及植物遗传转化的组织培养成功率过低。本研究在组织培养成功率难以大幅提高的情况下,通过优化CRISPR/Cas9系统来提高其编辑效率。主要方法如下:(1)哺乳动物的研究中发现通过优化gRNA的骨架结构能够显著地提高Cas9的编辑效率,本研究将验证该方法在植物中的可能性。本研究将gRNA的双链延长5 bp(UGCUG),并将连续序列中第四位胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)。将一个含有spacer1序列的原始gRNA和一个含有spacer2序列的优化gRNA构建到一个CRISPR系统中(GOG),同时将一个含有相同spacer1序列的优化gRNA和一个含有相同spacer2序列的优化gRNA构建在另一个CRISPR系统中(OGOG)。以spacer2位点的突变数为校准,比较spacer1位点上原始gRNA和优化gRNA的编辑效率。(2)对PDS基因编辑的研究结果表明,在CRISPR/Cas9系统中引入P19m可以抑制外源DNA的转录后沉默,同时又不会像P19那样引起植株异常死亡,本研究在此基础上进行了验证。本研究将P19的第127位点处的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),使P19蛋白的第43个氨基酸由精氨酸(Arg)突变为色氨酸(Trp)从而得到P19m蛋白。将P19m序列整合在CRISPR/Cas9系统的表达载体上,然后通过与报道的未加入P19元件的CRISPR/Cas9系统比较编辑效率,确认P19m对编辑效率的提升。(3)本研究通过优化的GoldenBraid构建CRISPR/Cas9载体系统,并优化了植物基因组DNA的提取流程和Peasy-ZERO载体的构建,实现操作流程的简化和实验操作速率的提升。并通过自制的大肠杆菌感受态来实现节约实验成本的可能。本研究通过靶定与miRNA相关基因的第一个外显子序列,对相关基因进行敲除,然后在T0代转基因植株中检测突变率,已经初步验证了通过优化gRNA骨架和引入P19m元件能够使CRISPR/Cas9系统在番茄基因组中的编辑效率得到提升。研究获得了六个不同转基因类型,共目前得到的编辑效率为71.4%。通过优化gRNA结构和引入P19m两个方面改造番茄中的CRISPR/Cas9基因编辑系统,得到了编辑效率的提升,并在此基础上优化表达载体构建和番茄遗传转化的方法,开发一套简便的标准化操作流程,使快速高效的基因编辑成为可能。