水稻是我国重要的粮食作物,常年播种面积和总产量均占粮食作物的首位。水稻生产在国民经济中占有十分重要的地位。国内外转Bt基因抗虫水稻在研发方面已经取得较大突破,其中我国政府于2009年批准了转基因抗虫水稻商业化应用生物安全证书,预示着转Bt基因水稻等重要农作物在未来农业生产中将发挥重要的作用。cry1Ah1基因是此前本实验室克隆的具有自主知识产权的模式基因,其编码的Cry1Ah蛋白对水稻二化螟(Chilo suppressalis)等多种鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性,超过目前商业化的cry1Ab、cry1Ac等基因,对研究抗虫转基因作物具有很好的应用前景。大量研究表明将野生型的Bt基因直接转入到植物中,表达量很低甚至不表达,而且不具有抗虫的实际效果,需要根据目标物种的密码子的偏好对外源基因进行密码子优化,以及必要的修饰,以提高Bt cry基因在转基因作物中的表达水平,这些工作是抗虫转基因植物研制成功的重要保证。本研究根据水稻氨基酸密码子的使用频率对cry1Ah1基因杀虫关键区域进行五种不同的优化,并加以必要的修饰,转化水稻日本晴后在分子水平上评估五种方案的差异,在转录和翻译水平上比较了不同优化方案之间的差别,并获得最佳优化方案,为Bt等原核生物基因优化和高效表达提供借鉴,为Bt抗虫转基因植物的研究奠定了坚实的基础。主要研究成果如下:在保证基因氨基酸序列不变的情况下,依据水稻密码子的使用频率对cry1Ah1基因的杀虫关键区域进行五种不同方案的优化和改造,使得G+C含量提高,并去除内含子剪切信号等不稳定因素,并在基因的上游添加了 Ω序列和Kozak序列,下游添加了内质网定位信号(KDEL)和双终止识别序列。最终合成2 077 bp序列于pUC57载体上,测序结果与预期设计的序列完全一致。将合成优化后各方案的基因构建原核表达载体pEB1Ah1、pEB1Ah2、pEB1Ah3、pEB1Ah4、pEB1Ah5,利用IPTG诱导在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中成功表达了与预期大小相同的65 kDa蛋白,表明优化后的基因在E.coli中能正常表达。表达蛋白对2龄小菜蛾和初孵水稻二化螟进行生物活性测定,在蛋白浓度为5 μg/mL时死亡率分别达到了33%、24%以上,蛋白浓度为50 μg/mL时死亡率为100%,具有良好的杀虫活性。结果表明由于基因优化没有改变氨基酸的序列,优化后基因对靶标害虫杀虫活性没有显著影响。将合成优化后各方案的基因构建植物表达载体pCAMBIA1300UAh1、pCAMBIA1300UAh2、pCAMBIA1300UAh3、pCAMBIA1300UAh4、pCAMBIA1300UAh5,利用农杆菌介导法转化水稻日本晴后,T0代成苗期PCR阳性率达到87%以上,经过实时荧光定量RT-PCR和ELISA分析表明全部采用最优密码子的优化方案效果最好,Cry1Ah蛋白平均表达量占可溶性蛋白的0.104%。