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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以仔猪呼吸障碍和母猪繁殖障碍为主要临床症状的烈性传染病。PRRSV于1996年在我国首次分离,给我国养猪业造成巨大经济损失。随着PRRSV在我国不断演化,其多样性变得更加复杂。形成了以Lineage 1和Lineage 8 PRRSV为主要流行毒株,Lineage 3 PRRSV持续存在的态势。Lineage 3 PRRSV（QYYZ-like）自2010年首次发现以来,主要流行于我国南方,但最近也有在我国其他地区分离这类病毒的报道。Lineage 3 PRRSV的早期毒株临床表现较为温和,因此未引起足够重视。而后的研究报道发现,Lineage 3 PRRSV与其他谱系毒株重组后毒力明显上升,因此加强对Lineage 3 PRRSV的监测是十分重要的。在动物疫病治疗、诊断、病原体生物学研究中,单克隆抗体发挥着重要作用。通过筛选具有阻断效果的针对PRRSV的单克隆抗体,是建立PRRSV抗体阻断ELISA的必备材料。目前国内报道的PRRSV单克隆抗体多数是针对HP-PRRSV,Lineage 3 PRRSV的单抗未见报道,因此制备Lineage 3 PRRSV的单抗对了解PRRSV基因组的结构与功能,以及进一步利用单抗制备PRRSV抗体阻断试剂盒具有重要意义。2017～2019年间,本研究对来自全国16个省、市、自治区的325份疑似感染PRRSV的病料进行RT-PCR检测。检测结果显示,阳性PRRSV样品数为103份,其中Lineage 3样品数为16份,约占阳性样品总数的16%。本研究对16份Lineage 3 PRRSV阳性样品进行ORF5基因测序,并在其中选择7个样品（LCL15、XNF10、XNF53、XNF60、XNF74、XNF78、XNF229）进行了全基因组测序,对获得的序列进行比对与分析。核苷酸序列同源性比对结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性与欧洲型代表株Lelystad virus的同源性为62.9%～65.0%,与美洲型代表株VR2332同源性在81.8%～85.1%;在美洲各型代表株中与QYYZ毒株（Lineage 3）的同源性最高,为91.2%～92.0%。全基因组同源性分析发现它们之间同源性较低,LCL15与Lineage 1代表株NADC30同源性最高,XNF53、XNF60、XNF78与Lineage 8代表株JXA1同源性最高,XNF10、XNF74、XNF229与Lineage 3代表株QYYZ同源性最高。基于ORF5基因的遗传演化分析结果显示,16份PRRSV毒株均属于在我国流行毒sublineage 3.5,而全基因组遗传演化分析显示XNF10、XNF74、XNF229属于sublineage3.5。XNF53、XNF60、XNF78属于sublineage 8.7,LCL15属于sublineage 1.8,与同源性分析结果相似。Nsp2基因推导氨基酸序列分析中发现,7株新发Lineage 3 PRRSV均在Nsp2区域存在大量复杂的缺失和插入。本研究报道的XNF10、XNF74、XNF78、XNF229在Nsp2蛋白上的缺失和插入模式均为首次报道。ORF5推导氨基酸序列比对结果表明Lineage 3PRRSV在Y38、S39、C66、S92、F117、I152、R196、H1998个位置的氨基酸存在特有的氨基酸突变,并且新发Lineage 3 PRRSV在线性抗原区域内存在大量氨基酸突变,这些位置的突变可能会导致疫苗免疫失败。重组分析结果显示7株新发Lineage 3 PRRSV毒株均为重组病毒,拥有非常复杂的重组关系,PRRSV毒株之间重组会对毒力造成较大影响。重组分析显示7株Lineage 3 PRRSV具有复杂的重组模式,其重组热点位于Nsp2、Nsp7、ORF2a和ORF3上。对新发Lineage 3 PRRSV进行病毒分离,成功分离XNF10株。本研究为深入探究Lineage3 PRRSV毒株在中国的变异和遗传进化提供了参考。本研究用超离纯化的Lineage 3 PRRSV XNF10株病毒免疫BALB/c小鼠三次,三免后7 d进行间接免疫荧光试验检测,结果显示小鼠血清转阳。将阳性小鼠脾脏在无菌条件下取出,冲出脾细胞并和SP2/0细胞进行细胞融合。经四次亚克隆,并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证,结果表明成功获得2株能够稳定分泌抗PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株,命名为DD-1、DD-2;将所获得的阳性杂交瘤细胞大量培养,并接种小鼠制备腹水。经IFA测定DD-1、DD-2细胞上清的效价分别为1:64和1:128。DD-1、DD-2腹水效价分别为1:5000和1:10000。利用IFA方法对单克隆抗体细胞系进行广谱性检测结果显示DD-1、DD-2均能与美洲型PRRSV代表毒株SD53-1603（Lineage 1）、Hu N4-F112（Lineage 8）、CH-1R（Lineage 8）、MLV（Lineage 5）反应,但不能与欧洲型代表株DV反应。因此DD-1、DD-2在美洲型PRRSV中具有很好地广谱性。利用Western blot方法对DD-1、DD-2的结合蛋白进行鉴定结果发现,两株新制备单克隆抗体都能与PRRSV的GP3特异性结合。用纯化的XNF10全病毒作为包被抗原,单克隆抗体DD-2与病毒的结合可以被PRRSV阳性的猪血清阻断。本研究制备的DD-2单克隆抗体为建立美洲型PRRSV抗体方法提供了基础。