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树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体内功能最强大的专职抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC),它能够调节机体的免疫应答,是先天性免疫和获得性免疫纽带。树突细胞靶向肽(DCpep)是一段可以特异性识别DCs表面配体的短肽,具有强大的抗原提呈能力。人源DCpep已被成功筛选出来,目前发现人源DCpep可以与黑猩猩、禽、犬、马和猫的DCs靶向性结合并且表达人源DCpep的口服疫苗可以引起较高的黏膜免疫和特异性免疫应答。然而,目前没有研究证实人源DCpep是否可以结合猪源DCs以及其对猪源DCs免疫功能的影响。因此,探究人源DCpep是否靶向于猪源DCs以及其对猪源DCs免疫功能的影响对于猪的新型靶向性口服疫苗开发具有重要的意义。本实验通过采集5-8周龄仔猪外周血,利用Ficoll密度梯度离心法提取出猪外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononμclear Cells,PBMCs),经体外无菌操作下一系列分裂诱导,培养出未成熟的猪单核源树突状细胞(Monocyte derived dendritic cells,Mo-DCs),通过对所培养的细胞进行形态学观察、分子表型和吞噬功能检测,证明了本方法可获得高纯度的MoDCs。为确定人源DCpep是否可靶向于猪源DCs,本研究将合成的带有荧光标记的人源DCs靶向肽(DCpep-FITC)与猪源DCs孵育,利用荧光显微镜和流式细胞术检测DCpep-FITC与猪源DCs的结合情况。结果表明,人源DCpep能与猪源DCs靶向性结合。为探究DCpep增强重组乳酸菌诱导肠道黏膜免疫的机制,以融合表达DCpep和猪流行性腹泻病毒(PEDV)中和抗原表位ps420的重组乳酸杆菌(p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393)为研究对象,以仅表达ps420的重组乳酸杆菌(p PG-T7g10-ps420/L.casei 393)为对照,将上述重组乳酸杆菌分别与Mo DCs孵育后,通过扫描电镜观察猪Mo DCs识别摄取重组乳酸杆菌的情况。结果表明,p PG-T7g10-ps420/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393均能够刺激猪Mo DCs发挥摄取和吞噬功能,但在相同时间内,猪Mo DCs捕获p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393的数量高于p PG-T7g10-ps420/L.casei 393。为探究DCpep对重组乳酸杆菌促进猪Mo DCs活化的影响,本研究分别将重组乳酸杆菌p PG-T7g10-PPT/L.casei 393、p PG-T7g10-ps420/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393与猪Mo DCs共培养,培养6 h、12 h和24 h时分别收集猪Mo DCs,利用流式细胞术和RT-q PCR检测Mo DCs表面分子及相关细胞因子的表达情况。流式细胞术的结果表明,p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420/L.casei 393可以显著促进Mo DCs表面分子MHC-Ⅱ类分子和CD80/86上调,且p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393比p PGT7g10-ps420/L.casei 393的促进作用更强。RT-q PCR检测结果表明,p PG-T7g10-PPT/L.casei393对Mo DCs表面分子CD40和CD80/86的表达没有明显的影响,而p PG-T7g10-ps420/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393均可显著促进Mo DCs表面分子CD40和CD80/86表达水平上调,且p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393比p PG-T7g10-ps420/L.casei393的作用更强。RT-q PCR检测Mo DCs表达Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)和相关细胞因子的表达水平,结果发现p PG-T7g10-PPT/L.casei 393对Toll样受体(TLR-2、TLR-4、TLR-6和TLR-9)和细胞因子(IL-12、IFN-γ和IL-10)表达的影响均不显著,p PG-T7g10-ps420/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393均能显著刺激Toll样受体(TLR-2、TLR-6和TLR-9)和细胞因子(IL-12、IFN-γ和IL-10)m RNA的表达增加,且p PGT7g10-ps420-DCpep/L.casei 393比p PG-T7g10-ps420/L.casei 393的作用更强。为验证DCpep对重组乳酸杆菌促进猪Mo DCs刺激T细胞增殖能力的影响,通过混合T淋巴细胞反应,以未刺激的Mo DCs作为对照组,经p PG-T7g10-PPT/L.casei 393、p PG-T7g10-ps420/L.casei 393和p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393作用的Mo DCs作为刺激细胞,T细胞为反应细胞,采用CCK-8试剂盒检测T细胞的增殖能力。结果显示,经重组乳酸杆菌刺激成熟的Mo-DCs均能够诱导T细增殖,且p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393比p PGT7g10-ps420/L.casei 393的作用更强。在Mo DCs与T细胞共培养的体系中采用ELISA方法检测其上清液,实验结果表明IFN-γ,IL-12,IL-10和IL-17的分泌量均上升,且p PG-T7g10-ps420-DCpep/L.casei 393比p PG-T7g10-ps420/L.casei 393的作用更强。综上所述,人源DCpep可与猪源Mo-DCs靶向性结合,有利于猪源Mo-DCs捕获重组乳酸杆菌,从而刺激猪源DCs的成熟。此外,人源DCpep能够促进猪源DCs对抗原的递呈和T细胞增殖,从而提高了重组乳酸杆菌将抗原传递给猪源DCs的效率,并可提升Mo DCs与T细胞共培养体系中IFN-γ,IL-12,IL-10和IL-17的分泌量。本研究结果为猪的DCs靶向性口服疫苗的研发提供了理论依据。