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生物脱胶因具有低能耗、低污染、低成本、高品质等优点,是红麻脱胶的发展万向。但是因为红麻胶质成分多样,酶催化非纤维素机制复杂,因此高效红麻脱胶菌株筛选难度大。本研究以红麻韧皮为底物,富集天然菌样中的微生物,通过宏基因组技术、可培养技术以及蛋白组技术,实时跟踪脱胶过程中的微生物多样性以及功能蛋白的变化规律,明确红麻生物脱胶优势菌群及差异蛋白,为红麻脱胶微生物的筛选、构建以及红麻生物脱胶的催化机制研究提供重要依据。 1、基于宏基因组技术,追踪从0h到150h的整个红麻脱胶过程,发现拟杆菌门Bacteroidetes的比例从30%升高到65%;而变形菌门Prteobacteria所占比例逐步下降,从55%下降到20%,TM7从1%上升到11%;厚壁菌门Firmicutes从0h的2%上升40h的20%,再降到150h的2%;放线菌Actinobacteria富集后,达到1%;其它各微生物种群比例低于1%,没有形成优势菌群,TOP30中未见真菌。到150h,Bacteroides sp成为第一优势菌群,而Chrysebacterium sp、Dysgonomonas sp、Flavobacterium sp、Acinetobacter sp、Citrobacter sp、Pseudomonas sp依次随后。 2、以红麻韧皮为富集基质,从土壤、水体、腐殖质样品菌样中分离筛选获得125个红麻韧皮脱胶菌株,其对应原料失重率≥21%,且在一种或多种选择性培养基中产生水解圈的菌株。分类鉴定结果表明,125个菌株隶属13属18种,其中116株细菌,9株丝状真菌。菌株K1-K5、R10、R13不产纤维素酶且非纤维素降解率大于21%,分别属于Bacillus subtihs、Paenibacillus polymyxa、Clostridium acetobutylicum、Bacillus alcalophilus、Erwinia chrysanthemi、Pseudomonas brassicacearum、Pectobacterium wasabiae。首次报道Bacillus alcalophilus、Erwinia chrysanthemi,以及Pectobacterium wasabiae具有红麻生物脱胶功能。其中菌株R13表现出优良的脱胶性能(Pectobacterium wasabiae IBFC2016,专利保藏号CGMCC No14601)。 3、菌株K1、K3、K4、K5及R13在三种不同的水解圈培养基上均形成了明显的水解圈,菌株K2在木聚糖酶水解圈培养基平板上培养10h不产生水解圈,菌株R10在木聚糖酶及甘露聚糖酶水解圈培养基平板上培养10h不产生水解圈。红麻生物脱胶发酵液上清液中,检测到的水解产物包括甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖,未检测到葡萄糖醛酸。随着发酵时间延长,半乳糖醛酸持续慢速增加,而其他单糖先增加后降低。整个纯培养过程中,果胶酶活、甘露聚糖酶活以及木聚糖酶活持续增加,15h时,果胶酶活、甘露聚糖酶活以及木聚糖酶分别是13025IU/mL、15758IU/mL以及11524IU/mL。果胶酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶在红麻韧皮生物脱胶过程中起到重要作用。 4、基于蛋白组iTRAQ技术,共鉴足到蛋白质总数197个。4组样本两两对比后所得差异蛋白在细胞组分上主要定位于细胞外基质、细胞外膜、细胞质、核糖体亚单位等多个位置。具有水解酶活性、氧化还原活性、超氧化物活性、纤维素结合活性、丙酮酸激酶活性、乌头酸水合酶活性、磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性、核苷二磷酸激酶活性等多种功能。参与碳水化合物结合、纤维素降解、氧化还原平衡、甘油醚代谢、羧酸代谢、乙醛酸循环、三羧酸循环、戊糖磷酸之路、生物合成等多种生物过程。蛋白A0A0R0DX68、A0A0R0EAU2、I4YJF1、V6SPC1系列、A0A0D6TR81、A0A0M9WBC6系列等,分别属于酯酶、糖水解酶、糖苷水解酶、烷基还原酶、醛基脱氢酶、葡聚糖酶,随着发酵时间增长,蛋白相对含量除酯酶110h达到高峰外,其余均持续增加。