研究背景肝癌是致死率最高的癌症之一,在全球癌症发病率和死亡率中位居第6位。肝细胞肝癌是临床上最常见的肝癌类型,具有高复发率和高死亡率的特点。肝细胞肝癌目前治疗方式包括手术切除、射频消融与靶向治疗等。其中经由美国FDA批准上市的药物索拉菲尼（Sorafenib）与乐伐替尼（Lenvatinib）分别可以通过针对性抑制癌细胞与相应的血管内皮细胞表面的PDGFR/VEGFR以及FGFR/RET等受体酪氨酸激酶家族,从而达到抑制血管生成、杀灭肿瘤细胞,从而达到减轻肿瘤负荷、延缓肝癌进展的作用。目前二者作为临床上一线肝癌治疗药物。然而,较高的肝癌复发与转移率,尤其是肝外转移,是影响肝癌患者治疗效果与生存时间的重要因素。有研究证实,索拉非尼在白种人和亚洲人的两项临床试验中分别将患者的生存时间延长了 2.8或2.3个月。最终患者多数死于肝癌转移,证明其治疗效果并不令人满意。因此,探寻更加有效的治疗靶点,对于阻止肝癌转移,增加治疗效果,延长患者生存时间,对临床治疗具有重要意义。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）是指从癌组织脱落入血的肿瘤细胞,其存在形式包括循环肿瘤细胞单体、循环肿瘤栓子与循环肿瘤细胞簇。循环肿瘤细胞被认为是癌症复发的根源,在癌症转移中起到重要作用。临床也已经证实,循环肿瘤细胞,尤其是循环肿瘤栓子的存在,与患者无进展生存期及总体生存期的缩短、复发与远发转移概率的升高密切相关。循环肿瘤细胞具备抵抗失巢凋亡的能力,这使得它们在脱离细胞外基质后仍然能在循环系统中生存。多种信号通路,如Ras/MAPK通路,参与到了循环肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的机制中。循环肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的机制目前仍不清楚。因此,寻找循环肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的机制,对寻找针对肝癌转移的方法,具有重要的意义。受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinases,RTKs）目前被认为在肿瘤发生与癌症转移中起关键作用。人类基因组能够编码90中具有酪氨酸激酶活性的蛋白,其中58种蛋白定位于细胞膜上。进一步划分,这58种蛋白可分为20个亚家族。它们属于同一个膜蛋白家族,可以催化ATP的γ磷酸酯转移到靶蛋白酪氨酸酶的羟基上,并在细胞周期、迁移、代谢、增殖与分化等最基本的细胞生命活动中起重要作用。某些受体酪氨酸激酶,如VEGFR/PDGFR家族可用于原发性肝癌的靶向治疗,其作用机制包括直接杀伤肝癌细胞,也可以针对肿瘤诱导的血管生成,从而阻断肿瘤血供而发挥抗癌作用。不仅如此,一些受体酪氨酸激酶,如EGFR与MET,可以通过直接突变、扩增、与整合素等分子形成共受体,诱导对靶向药物的耐药性等方式来参与肿瘤的转移。受体酪氨酸激酶可能对循环系统中的肿瘤细胞存活和远发转移至关重要。文献证实,在悬浮培养的肿瘤细胞中观察到EGFR过度磷酸化。EGFR和ErbB2在一些临床研究中也被作为鉴别循环肿瘤细胞的标志物,有临床报道在非小细胞肺癌患者的循环肿瘤细胞种中也发现了MET扩增,这些都证明了受体酪氨酸激酶参与了循环肿瘤细胞的存活。然而,由于循环肿瘤细胞数量稀少,受体酪氨酸激酶在循环肿瘤细胞的存活与转移所起到的作用并不完全清楚。受体酪氨酸激酶的表达和磷酸化水平在各种肿瘤中大不相同。因此,选择最具表达性和功能性的受体酪氨酸激酶是肝癌治疗的关键。综上,本研究主要分为三个部分:第一部分,我们对临床肝癌组织与肝癌细胞进行蛋白定量分析,从受体酪氨酸激酶家族中筛选出EGFR与MET两个表达量高、功能强的分子,并利用小鼠荷瘤模型,证明了 EGFR与MET在肝癌循环肿瘤栓子中表达上调,在肝癌肺转移组织中表达下调;第二部分,通过建立失巢模型,体外验证EGFR与MET在失巢状态下的功能变化、对失巢肝癌细胞稳定性和抵抗白细胞杀伤的影响及相关机制,并研究两者在相关通路的协同调节作用;第三部分,通过药物抑制、小干扰等方法,验证EGFR与MET对其他受体酪氨酸激酶磷酸化的影响及机制以及两者之间的相互作用。本研究从全新角度阐述了EGFR和MET在促进肝癌转移方面的相关机制,为肝癌肺转移的预防、检测与治疗提供了全新的思路。第一部分EGFR与MET在循环肿瘤栓子中表达上调研究目的EGFR与MET在肝癌转移中发挥重要作用,但其在转移前后及在循环肿瘤栓子中表达状况仍不清楚。本部分旨在探究EGFR与MET在肝癌肺转移过程中的表达和磷酸化水平变化以及在循环肿瘤栓子中的表达状况。研究方法1.筛选肝癌组织内表达水平较高的受体酪氨酸激酶分子。运用酶联免疫吸附测定及Luminex定量检测肝癌组织、细胞中常见受体酪氨酸激酶的表达水平,并对同一组织不同受体酪氨酸激酶进行定量比较,筛选出EGFR与MET两个表达水平最高的受体酪氨酸激酶。使用免疫印迹检测技术对不同细胞系的EGFR与MET的表达水平与磷酸化水平进行比较。同时,运用酶联免疫吸附测定及Luminex定量检测组织与细胞内EGFR和MET的配体EGF、HGF的含量。2.检测肝癌肺转移前后EGFR与MET的表达与磷酸化情况。构建C57小鼠肝癌转移模型。收集肝癌肺转移组织与原发肝癌组织,使用细胞分离液将小鼠肝与肺分散为单细胞后进行测序,通过UMAP将细胞分为不同的簇并挑选出肿瘤细胞簇。同时使用鼠源受体酪氨酸激酶磷酸化检测试剂盒,观察小鼠肝癌肺转移前后肿瘤组织中EGFR与MET的磷酸化状况。3.检测循环肿瘤栓子中EGFR与MET的表达情况。我们收集了小鼠肝癌转移模型中的肝癌组织与肝癌肺转移组织,通过连续切片免疫组化与免疫荧光的方法,寻找肿瘤组织中的循环肿瘤栓子。通过ImageJ软件定量分析同一张免疫组化切片中肿瘤组织与循环肿瘤栓子染色强度,比较两者之间EGFR与MET的表达差异。研究结果1.与其他受体酪氨酸激酶家族成员相比,EGFR和MET在肝癌组织与细胞中表达量相对较高。通过Luminex与酶联免疫吸附测定方法可以发现,EGFR和MET在肝癌组织与细胞中的表达量都较高,尤其是在细胞中,EGFR和MET的表达量远远高于其他受体酪氨酸激酶在细胞中的表达水平。而且,EGFR在不同细胞系表达水平几乎一致,在具有MET扩增的细胞系中EGFR与MET的磷酸化水平普遍上升。同时,对EGFR与MET的配体进行定量分析后发现,EGF无论是在肝癌组织还是细胞中表达量均很低,而HGF在肝癌组织中表达量高,在细胞中表达量较低。2.EGFR与MET在肺转移后表达量明显降低。通过对单细胞测序的热度图分析,我们发现EGFR与MET集中表达在肝癌组织中的肝癌细胞。肺转移后肝癌组织出现了包括EGFR与MET在内的受体酪氨酸激酶家族整体表达水平下降的情况。但磷酸化芯片证实EGFR与MET的磷酸化水平在肝癌转移前后保持一致。3.EGFR与MET在肝癌组织中分布不同,在循环肿瘤栓子中表达量明显上升。对肝癌原发灶与肺转移继发灶进行免疫组化与荧光分析后,我们发现,EGFR与MET在不同组织中呈现很大的表达差异。其中,在肝脏中,肝癌细胞EGFR表达水平低于正常肝脏组织,但MET高于正常组织;在肝癌肺转移灶中,肿瘤细胞EGFR表达水平高于绝大部分正常肺组织,而MET表达水平与肺组织基本持平。同时,较同一器官（肝或肺）的肿瘤组织相比,循环肿瘤栓子中EGFR与MET表达均出现明显上升。其中,在肝癌原发灶中,EGFR上升的更加明显。第二部分EGFR与MET诱导的失巢凋亡抵抗促进循环肿瘤栓子存活并抵御白细胞杀伤作用研究目的通过上一部分我们已经证明受体酪氨酸激酶家族中EGFR与MET在肝癌组织中的表达优势以及在循环肿瘤栓子中的表达上调。而EGFR与MET表达上调对循环肿瘤栓子的作用仍不明确。循环肿瘤栓子的一个重要特性是失巢凋亡抵抗。本部分旨在通过构建体外失巢凋亡抵抗模型观察EGFR与MET对循环肿瘤栓子的存活和白细胞杀伤的影响,并探讨其机制。研究方法1.验证失巢凋亡抵抗模型中EGFR与MET的表达和磷酸化水平。运用免疫印迹检测技术与受体酪氨酸激酶磷酸化芯片,分别检测细胞在正常培养与失巢状态（24、48、72小时）下,EGFR与MET的表达状况与磷酸化水平。悬浮细胞维持在较低浓度防止细胞成团。2.验证EGFR与MET促进细胞因子分泌与抵抗白细胞的杀伤作用。使用酶联免疫吸附法测定细胞内与细胞分泌的白介素-8的表达情况。同时,使用不同抑制剂预处理后,将肝癌细胞与白细胞共培养,通过观察肿瘤细胞与白细胞的存活状况,验证EGFR与MET保护肝癌细胞抵抗白细胞的杀伤作用。3.验证EGFR与MET对Ras/MAPK通路的调控作用。通过配体激活与抑制剂预处理实验,观察EGFR与MET对Ras/MAPK通路的调控作用,以及它们的基础磷酸化水平对Ras/MAPK通路的激活/抑制的影响;比较不同配体对对应的受体酪氨酸激酶的激活作用,验证受体酪氨酸激酶家族中EGFR与MET对Ras/MAPK通路的调控力度;观察EGFR与MET表达水平较低的肝癌细胞中相关抑制剂的作用强度,证明EGFR与MET对Ras/MAPK通路的协同调控作用。4.验证Ras/MAPK通路对失巢状态下的肝癌细胞周期、凋亡,以及对白细胞杀伤抵抗作用的影响。首先确定失巢状态下肝癌细胞Ras/MAPK的激活水平,然后探究失巢状态以及加入Ras/MAPK抑制剂后肝癌细胞的周期、DNA合成、细胞凋亡与周期蛋白的表达水平。同时,失巢状态与正常状态相比,观察失巢状态下抑制Ras/MAPK通路前后肝癌细胞对白细胞杀伤的抵抗作用的变化情况。研究结果1.EGFR与MET在失巢状态下的肝癌细胞中表达与磷酸化水平均升高。我们首先利用循环肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗特点,构建了体外循环肿瘤栓子模型。我们发现,肝癌细胞处于失巢状态下大约24-48小时之间,EGFR与MET磷酸化水平与表达水平达到峰值,随后出现回落。2.EGFR与MET参与了白介素-8的分泌及白细胞的杀伤作用的抵抗。我们通过酶联免疫吸附法观察到白介素-8的分泌与EGFR及MET的磷酸化水平之间存在关联。在MET扩增的肝癌细胞中,EGFR与MET磷酸化水平极高。抑制该细胞系的EGFR与MET磷酸化会导致白介素-8的合成与分泌水平显著下降。但在EGFR与MET低磷酸化水平的细胞系中,其抑制效果则不太明显。同时,抑制EGFR与MET的肝癌细胞也表现出对白细胞杀伤抵抗能力的下降。3.EGFR与MET对Ras/MAPK通路具有强有力的调控作用。3.1 EGFR与MET对Ras/MAPK通路的调控能力与其在肝癌细胞中的磷酸化水平相关。我们通过激活或抑制EGFR与MET的功能,发现EGFR与MET对Ras/MAPK通路的调控能力在不同的肝癌细胞中是不一致的。其中,EGFR与MET磷酸化水平较高的细胞系中Ras/MAPK通路对激活剂不敏感,但对抑制剂敏感;相反,EGFR与MET磷酸化水平较低的细胞系中Ras/MAPK通路对激活剂敏感,但对抑制剂相对不敏感。3.2 EGFR与MET对Ras/MAPK通路调控能力强于其他受体酪氨酸激酶。我们通过利用目前临床上已经用于治疗肝癌的受体酪氨酸激酶的相关配体激活受体酪氨酸激酶,探究其对Ras/MAPK途径的调控能力。我们发现,使用不同配体激活对应的受体酪氨酸激酶,EGF的激活能力最强,其次是HGF,而FGF2、Insulin、VEGF与PDGF-BB激活能力要远逊于EGF与HGF。同时,在已经敲除EGFR或MET的细胞系中,FGF2、VEGF与PDGF-BB也无法完全恢复EGFR或MET敲除之前Ras/MAPK的激活程度。3.3 EGFR与MET对Ras/MAPK通路调控存在协同作用。我们使用EGFR抑制剂对敲除或激活MET的肝癌细胞进行抑制,观察Ras/MAPK通路激活的变化。我们发现,对EGFR抑制剂敏感的肝癌细胞,EGFR抑制剂对MET也有显著的影响,而对EGFR抑制剂不敏感的肝癌细胞,EGFR抑制剂对MET的作用并不显著。同时,MET敲除后肝癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性也出现了下降趋势。4.Ras/MAPK通路可以稳定失巢状态下的肝癌细胞并参与抵抗白细胞对它们的杀伤作用。我们发现,在失巢状态下,肝癌细胞中Ras/MAPK通路呈现激活状态。而且处于S期的肝癌细胞的数量明显上升。同时,CyclinE的表达显著上调、而Cyclin A与Cyclin B的表达显著下调。抑制Ras/MAPK通路后,所有的Cyclin与CDK4蛋白表达均显著下调、处于S期的肝癌细胞比率降低、DNA合成被明显抑制。同时,我们发现在失巢状态下,Ras/MAPK通路抑制剂AZ628会促使肝癌细胞的凋亡率进一步上升;当Ras/MAPK通路受到抑制之后,肝癌细胞对白细胞杀伤作用的抵抗能力也出现了显著下降。第三部分EGFR与MET参与到多种受体酪氨酸激酶的激活研究目的前面的研究证实了 EGFR与MET对于循环肿瘤栓子存活的影响和机制。而在临床治疗中肝癌转移率始终居高不下,并成为导致患者临床治疗效果不佳与生存时间缩短的重要因素。因此,本部分旨在研究EGFR与MET在肝癌耐药中的作用及可能的相关机制。研究方法1.抑制EGFR与MET后,检测临床常用的针对受体酪氨酸激酶治疗靶点分子的磷酸化状况。通过EGFR与MET药物及小干扰特异性抑制EGFR与MET磷酸化水平,观察VEGFR、FGFR、RET、PDGFR等受体酪氨酸激酶的磷酸化水平。2.观察临床受体酪氨酸激酶靶向药物对不同肝癌细胞受体酪氨酸激酶的抑制作用。通过加入索拉菲尼与乐伐替尼等临床上应用的受体酪氨酸激酶抑制剂,观察肝癌细胞中不同的酪氨酸激酶受体磷酸化的抑制状况,判断EGFR与MET在肝癌细胞抵抗受体酪氨酸激酶抑制剂中发挥的作用。3.探讨EGFR与MET促进受体酪氨酸激酶磷酸化的相关机制。通过免疫共沉淀来确定EGFR与MET之间是否存在异二聚体或同源二聚体。此外,通过细胞裂解产物与ATP/GTP共孵育,所得到混合物利用蛋白印迹检测技术与人受体酪氨酸激酶磷酸化试剂盒检测受体酪氨酸激酶磷酸化状况,了解EGFR与MET激活可能机制。研究结果1.EGFR与MET可以有效促进多种受体酪氨酸激酶磷酸化水平提升。我们通过加入EGFR与MET抑制剂或小干扰,观察肝癌细胞中其他受体酪氨酸激酶的磷酸化水平的变化情况。我们发现,在MET扩增的细胞系中,EGFR与MET抑制剂可以直接抑制大部分受体酪氨酸激酶磷酸化水平。而敲除MET也有同样的作用。而且,配体的刺激也无法升高相关受体酪氨酸激酶的磷酸化水平。但在EGFR与MET磷酸化水平不高的肝癌细胞中,这种效果相对较差。2.EGFR与MET参与了受体酪氨酸激酶靶向药物的耐药性。我们发现,索拉菲尼对EGFR与MET的抑制作用不明显,同时,在MET扩增细胞系中,其对PDGFR等受体也几乎没有抑制作用,而乐伐替尼对EGFR与MET有较好的抑制作用,在MET扩增的细胞系中尤其明显,并且对其所针对的靶点也具有较好的抑制能力。这意味着非针对EGFR与MET的靶向药物在肝癌细胞,尤其是出现MET扩增的肝癌细胞系中作用十分有限。3.EGFR与MET无法以异源二聚体的形式参与到受体酪氨酸激酶的活化。我们发现,在HCCLM3等具有MET扩增的细胞系中受体酪氨酸激酶的磷酸化水平普遍要高于普通的肝癌细胞系。因此我们探究了受体酪氨酸激酶激活的可能机制,发现即使是在MET扩增的细胞系中,EGFR或MET也很难形成异源二聚体。相反,EGFR或MET更倾向于形成同源二聚体。4.高能磷酸化合物是受体酪氨酸激酶活化的关键因素。我们发现,在细胞裂解液中,如果给予充足的ATP,包括MET扩增的肝癌细胞系,大部分受体酪氨酸激酶均可出现磷酸化,但MET磷酸化水平几乎不受ATP影响,这意味着ATP并不能直接磷酸化MET。同时,ATP可以直接磷酸化EGFR,而不能磷酸化MET,对EGFR的磷酸化不受MET的影响;而GTP可以直接磷酸化EGFR与MET。研究结论1.EGFR与MET是肝癌中表达最为丰富的受体酪氨酸激酶分子之一,在肝癌的转移中发挥着重要作用。2.EGFR与MET在肝癌肺转移后表达水平降低,但在循环肿瘤栓子表达上升,意味着针对EGFR/MET进行预防性治疗,可能成为阻止循环肿瘤栓子的产生乃至肝癌转移的重要手段。3.失巢凋亡抵抗是导致循环肿瘤栓子EGFR与MET表达与磷酸化水平上升的重要因素。4.相较于其他受体酪氨酸激酶分子,EGFR和MET对Ras/MAPK通路的调控能力更强,意味着EGFR与MET在稳定循环肿瘤栓子与抵抗白细胞杀伤中起到重要作用。5.EGFR与MET参与了临床靶向药物治疗的耐药,其机制可能与高能磷酸化合物相关。