第一部分 糖尿病管周脂肪组织的异常及其Cfd+巨噬细胞在血管病变中的作用机制研究背景随着社会经济的发展,2型糖尿病（T2DM）发病率迅速增加,我国糖尿病患者的数量高达9240万人。T2DM患者更易患各种心脑血管疾病,这些血管并发症是患者死亡的主要原因。大量研究表明脂肪组织的细胞组成和功能异常在T2DM血管并发症的发病中发挥核心作用。然而目前大部分研究集中于内脏脂肪组织,对与血管功能关系密切的管周脂肪组织（PVAT）的研究仍然较少。PVAT能分泌各种脂肪因子和细胞因子,通过旁分泌或内分泌等方式调节血管功能。PVAT主要包括脂肪细胞和基质血管成分（SVF）。SVF包括脂肪来源的干细胞（ADSC）、内皮细胞和免疫细胞等多种细胞成分,是PVAT细胞组成和功能复杂性的主要贡献者。大量研究认为,PVAT细胞组成和功能异常在动脉粥样硬化（AS）的发生发展中发挥关键作用。如AS患者的主动脉PVAT中免疫细胞（巨噬细胞和T细胞）浸润明显增加,促进脂肪组织炎症,损伤血管功能。然而,目前对PVAT的细胞组成和功能及其在糖尿病中的异常和病理意义仍缺乏系统认识。巨噬细胞是PVAT中最重要的免疫细胞之一。近年来,越来越多的研究表明巨噬细胞类型和功能的复杂性远超过M1和M2的简单分类,而且脂肪组织中的巨噬细胞具有高度的异质性和可塑性。然而,迄今为止人们对巨噬细胞,特别是PVAT中巨噬细胞的类型和功能,以及各细胞间通讯在T2DM血管病变中的异常和意义仍然了解不多。脂肪细胞在PVAT中数量最多,是PVAT中脂肪因子和细胞因子的主要来源,在血管功能调控和糖尿病血管病变中发挥重要作用。脂肪细胞也是PVAT中其他细胞作用的主要靶标,这些细胞能通过脂肪细胞间接调控血管功能。然而,迄今为止,PVAT中其他细胞与脂肪细胞之间的相互调控网络仍未完全阐明。近年来,单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展为解决上述问题提供了有效手段。然而,目前使用scRNA-seq技术对PVAT的研究主要集中在PVAT中的ADSC等非免疫细胞,对PVAT的细胞组成和功能特征,及其在T2DM中的异常改变和意义仍然知之甚少。本研究拟通过scRNA-seq技术描绘PVAT中SVF细胞组成和功能的异质性及其在T2DM中的特征性改变,并通过体外实验验证PVAT中Cfd+巨噬细胞在血管病变中的作用和机制,为探究糖尿病血管病变的发生机制及治疗手段提供新的思路。研究目的1.阐明管周脂肪组织中SVF的细胞组成/类型和功能及其在糖尿病中的特征性改变。2.揭示管周脂肪组织中SVF各细胞群间的相互调控网络及其在糖尿病中的特征性改变。3.以Cfd+巨噬细胞亚群为重点,阐明其通过巨噬细胞-脂肪细胞通讯发挥血管保护作用的机制。研究方法1.利用单细胞测序数据分析揭示PVAT中SVF的细胞组成、功能和细胞间通讯,以及它们在T2DM中的特征性改变,并对特定巨噬细胞亚群进行实验验证（1）通过高糖高脂饮食和低剂量链脲佐菌素（STZ）联合处理,建立T2DM大鼠模型;（2）分离正常和T2DM大鼠管周脂肪组织的SVF,制备单细胞悬液并构建测序文库,进行单细胞测序;（3）利用多种生物信息学工具,分析管周脂肪组织中SVF的细胞类型、功能和细胞间通讯、以及它们在糖尿病中的特征改变;（4）利用免疫荧光共定位证实scRNA-seq发现的巨噬细胞亚群在T2DM样本中的数量改变。2.建立脂肪细胞和巨噬细胞共培养体系,探究Cfd+巨噬细胞对脂肪细胞功能的调节作用（1）从大鼠体内分离PVAT来源的脂肪细胞,并通过流式细胞仪分选PVAT来源的Cfd+巨噬细胞;（2）将分离的PVAT来源的脂肪细胞或3T3-L1脂肪细胞置于Transwell系统的下层培养,将流式细胞仪分选的PVAT来源的Cfd+巨噬细胞置于Transwell系统的上层培养;（3）利用Western Blot和qRT-PCR等检测脂肪细胞中胰岛素信号通路相关分子的表达,以及脂肪因子和细胞因子的水平,证实Cfd+巨噬细胞对脂肪细胞功能的调控作用。3.建立三元（血管、脂肪细胞、巨噬细胞）共培养体系,探究Cfd+巨噬细胞对血管功能的调节作用（1）从大鼠体内分离主动脉及其PVAT来源的脂肪细胞;（2）通过流式细胞仪分选PVAT来源的Cfd+巨噬细胞;（3）将分离的带或不带PVAT的大鼠主动脉置于Transwell系统的下层培养,将上述分离的脂肪细胞和巨噬细胞用接触系统共培养于Transwell系统的上层;（4）利用Western Blot、免疫组化和qRT-PCR等检测血管内皮和平滑肌功能相关指标,以及血管中多种细胞因子的水平,在体外证实Cfd+巨噬细胞对血管功能的作用。4.利用siRNA抑制脂肪细胞中C5L2受体的表达,并与Cfd+巨噬细胞共培养,通过Western Blot和ELISA等方法探究Cfd+巨噬细胞影响脂肪细胞功能的机制。研究结果1.建立T2DM大鼠模型通过高糖高脂饲料喂养联合低剂量STZ腹腔注射,诱导SD大鼠T2DM,模型组大鼠的血糖显著升高,体重明显减轻,提示T2DM模型构建成功。2.管周脂肪组织中SVF的细胞类型和功能有明显的异质性大鼠管周脂肪组织SVF由9种类型的细胞组成,包括非免疫细胞和免疫细胞。其中非免疫细胞有4种:ADSC、成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞;免疫细胞有5种:巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞。巨噬细胞分为4个亚群,参与炎症应答、胰岛素敏感性、细胞因子分泌和淋巴细胞趋化等过程;NK细胞也可以分为4个亚群,与免疫、代谢重编程、细胞毒性等功能有关;T细胞分为6个亚群,涉及T细胞增殖、凋亡、活化等过程,参与细胞免疫应答;ADSC和平滑肌细胞都可以进一步细分为2个亚群,参与血管重构、炎症反应、脂代谢调控等过程。3.T2DM大鼠管周脂肪组织中SVF的细胞组成和功能显著改变与正常大鼠相比,T2DM大鼠管周脂肪组织中SVF的细胞种类没有变化,但巨噬细胞和NK细胞显著增多,并且多个巨噬细胞和NK细胞亚群的数量也明显改变。此外,SVF中各类细胞的炎症和血管新生功能都普遍增强。4.巨噬细胞是管周脂肪组织SVF中各类细胞间通讯的关键枢纽细胞通讯分析表明,SVF中各类细胞之间存在复杂的相互作用/通讯,并且在T2DM大鼠样本中明显增多增强。此外,我们还发现无论是作为配体还是受体,巨噬细胞与其他类型细胞（包括免疫细胞和非免疫细胞）之间的通讯数量和强度都是最多的,并在T2DM大鼠PVAT中显著增多增强,这提示巨噬细胞在管周脂肪组织SVF的细胞间通讯中发挥重要的桥梁和枢纽作用。5.T2DM大鼠PVAT中Cfd+巨噬细胞亚群的数量显著减少我们发现PVAT中的巨噬细胞有4个功能不相同的亚群,其中Cfd+巨噬细胞的数量在T2DM大鼠PVAT样本中显著减少,免疫荧光共定位实验的结果也证实了Cfd+巨噬细胞在T2DM大鼠PVAT中的比例显著下降。而且,我们还发现,Cfd+巨噬细胞亚群主要分布在PVAT中,在内脏脂肪组织和皮下脂肪组织中的分布很少,具有明显的组织特异性。6.Cfd+巨噬细胞能显著改善T2DM大鼠的血管病变（1）Cfd+巨噬细胞具有明显的血管保护作用:为揭示在T2DM大鼠PVAT中显著减少的Cfd+巨噬细胞的功能,我们利用带或不带PVAT的主动脉血管与Cfd+巨噬细胞组成的共培养体系进行了进一步研究。结果表明,Cfd+巨噬细胞能显著增加T2DM大鼠主动脉血管一氧化氮（NO）的水平,促进平滑肌向收缩型表型转化,降低多种促炎细胞因子的水平,而上调抗炎细胞因子IL-10的水平。并且上述血管保护作用依赖于PVAT。（2）Cfd+巨噬细胞的血管保护作用依赖于脂肪细胞:将从T2DM大鼠中分离的不带PVAT的主动脉血管与PVAT来源的脂肪细胞和流式细胞仪分选的Cfd+巨噬细胞共培养,结果表明三者共培养能显著降低T2DM大鼠主动脉血管中活性氧（ROS）的水平,减轻氧化应激,增加血管NO水平,促进平滑肌向收缩型表型转化,并且减轻血管炎症。然而,当共培养体系中缺少脂肪细胞时,Cfd+巨噬细胞的上述血管保护作用消失。以上结果提示Cfd+巨噬细胞的血管保护作用依赖于PVAT中的脂肪细胞。7.Cfd+巨噬细胞能调控脂肪细胞对胰岛素的反应和活性因子的表达（1）Cfd+巨噬细胞能显著改善脂肪细胞的胰岛素抵抗:将流式细胞仪分选的PVAT来源的Cfd+巨噬细胞与3T3-L1脂肪细胞（或PVAT来源的原代脂肪细胞）共培养,结果表明Cfd+巨噬细胞能增加脂肪细胞的葡萄糖消耗,增强胰岛素信号通路,改善脂肪细胞的胰岛素抵抗。（2）Cfd+巨噬细胞能显著影响脂肪细胞中脂肪因子和细胞因子的表达:利用流式细胞仪分选的PVAT来源的Cfd+巨噬细胞与3T3-L1脂肪细胞（或PVAT来源的原代脂肪细胞）共培养,我们发现Cfd+巨噬细胞能显著下调脂肪细胞中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、MCP-1）和血管收缩因子（Resistin、AngⅡ）的表达,上调抗炎细胞因子（IL1RN、IL-10）和血管舒张因子（Adiponectin、Omentin）的表达。8.Cfd+巨噬细胞通过Cfd-C3-ASP-C5L2轴调控脂肪细胞功能Cfd+巨噬细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养,可以显著减少培养上清中补体C3的水平,增加酰化刺激蛋白（ASP）水平。ASP可以与脂肪细胞表面C5L2受体结合,显著增加3T3-L1脂肪细胞中Akt的磷酸化,并促进GLUT4的表达和膜转位。利用siRNA敲低脂肪细胞中C5L2受体的表达能显著抑制上述Cfd+巨噬细胞对脂肪细胞功能的调控。结论1.大鼠管周脂肪组织中SVF的细胞组成和功能有很强的异质性;它们在T2DM中发生显著改变,特别是巨噬细胞和NK细胞及其亚群的比例变化显著;而且,各类细胞中与炎症和血管新生相关的功能都明显增强。2.管周脂肪组织SVF中各细胞群之间存在复杂的通讯,并且在T2DM中明显增强;巨噬细胞作为关键节点在上述细胞通讯中发挥重要作用。3.Cfd+巨噬细胞能通过Cfd-C3-ASP-C5L2轴显著改善脂肪细胞的胰岛素抵抗,调节脂肪细胞中脂肪因子和细胞因子的表达,从而抑制炎症,改善血管内皮功能,促进平滑肌向收缩型转化,发挥血管保护作用。第二部分 miRNA线粒体-胞浆分布变化在TSH诱导的肝脂代谢异常中的作用和机制研究背景近年来人们的生活节奏明显加快,承受的各种压力迅速增加,导致以甲状腺功能减退症为代表的多种自身免疫性疾病的发病率持续增加。约90%的甲状腺功能减退症患者表现为亚临床甲减（SH）,其特点主要是血清中促甲状腺激素（TSH）水平升高,而FT3和FT4的水平正常。迄今为止,很多流行病学的研究证明TSH水平升高是动脉粥样硬化等心血管疾病和代谢综合征的重要独立危险因素之一,但其分子机制目前仍未完全阐明。肝脏是机体脂代谢的重要器官和关键调节者。研究发现SH患者存在明显的肝脏脂代谢紊乱。然而,SH与肝脂肪变性和非酒精性脂肪肝（NAFLD）之间的相关性目前仍存在争议。有研究认为SH是NAFLD发生和发展的重要危险因素;但也有研究认为SH与NAFLD无关或只在男性中才有关系。既往研究表明肝细胞表面存在功能性TSH受体（TSHR）,TSH与肝细胞表面的TSHR结合,通过调节下游脂代谢通路中关键分子的表达促进了肝脏甘油三酯（TG）的积累,导致高胆固醇血症;还能通过调节肝脏中胆汁酸的合成,最终引起肝脏脂代谢紊乱。miRNA是一类具有调控功能的非编码小RNA,几乎参与所有生命过程,在肝脏脂代谢紊乱的发生和发展中发挥重要作用。许多miRNAs可以通过靶向脂代谢过程中的关键酶直接调控肝脏脂代谢;也能通过靶向脂代谢通路中的关键分子间接调控肝脏脂代谢。线粒体是肝细胞中含量最丰富的细胞器之一,也是肝脏脂代谢及其调控的关键节点。线粒体中存在大量miRNAs,它们大部分都由细胞核编码,能重新进入胞浆,通过调节靶基因的表达参与肝脏脂代谢。miRNA在线粒体与胞浆间的分布与细胞和线粒体的功能密切相关。分布在线粒体中的miRNAs,即使在细胞中的总表达量不变,也可以通过改变其在线粒体-胞浆间的分布来发挥转录后调控作用,从而调节细胞和线粒体功能。然而,迄今为止对这一调控方式的生理和病理意义及其机制仍知之甚少,miRNA线粒体-胞浆分布变化在TSH诱导的肝脂代谢异常中的作用和机制目前仍没有研究报道。本研究旨在筛选线粒体-胞浆分布显著变化的miRNAs,并进一步验证其在TSH诱导肝细胞脂质聚积中的作用和机制,为探究亚临床甲减患者脂代谢紊乱的分子机制提供新的见解。研究目的1.揭示在TSH诱导肝细胞脂代谢异常的过程中,miRNA线粒体-胞浆分布的变化特点。2.以线粒体-胞浆分布变化最显著的miRNAs为代表,阐明miRNA线粒体-胞浆分布异常在TSH诱导肝细胞脂代谢紊乱中的作用及其机制。研究方法1.通过Small RNA测序技术探究miRNA在线粒体和胞浆中的分布变化（1）分离纯化TSH处理和未处理的HepG2细胞的线粒体,提取细胞和线粒体的RNA,然后进行Small RNA测序;（2）利用多种生物信息学工具分析测序数据,筛选出与未处理的对照组HepG2细胞相比,细胞总表达量不变,但在线粒体中的含量显著改变miRNAs;（3）利用绝对定量PCR,进一步验证筛选出的miRNAs在总RNA、线粒体RNA和胞浆RNA中含量的变化;（4）利用原位杂交实验证实上述筛选出的关键miRNAs在线粒体和胞浆中的分布变化。2.miRNA靶基因的预测和验证（1）通过多种靶基因预测软件预测这些细胞总表达量不变,但在线粒体中含量显著改变的miRNAs与脂代谢相关的靶基因,并进行功能富集分析;（2）通过转染 miRNA mimics 或 miRNA inhibitors,利用 Western Blot、qRT-PCR 和双荧光素酶报告基因实验验证关键miRNAs的靶基因。3.检测关键miRNAs及其靶基因在HepG2细胞脂质代谢中的作用（1）在 HepG2 细胞中转染 miRNA mimics、miRNA inhibitors,或共转染 miRNA mimics及其对应靶基因的表达载体;（2）通过油红O染色评估HepG2细胞中甘油三酯的沉积;（3）利用Western Blot和qRT-PCR检测各组HepG2细胞中下游脂代谢通路关键信号分子的表达;（4）利用气-质联用仪检测各组HepG2细胞中非常长链脂肪酸（VLCFA）水平。4.检测关键miRNAs及PPARα在HepG2细胞脂质代谢中的作用（1）在HepG2细胞中转染miRNA mimics和（或）PPARα表达载体;（2）利用Western Blot和qRT-PCR检测各组细胞中脂肪酸β-氧化关键酶的表达;（3）检测各组细胞耗氧量和耗氧率,以及酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）的活性;（4）检测各组细胞中脂肪酸（FA）的水平。5.检测关键miRNAs在TSH促进HepG2细胞脂质聚积中的作用（1）在HepG2细胞中转染miRNA inhibitors,并用TSH处理;（2）检测各组细胞中脂肪酸β-氧化关键酶的水平和脂肪酸的水平;（3）检测各组细胞耗氧量和耗氧率,以及ACOX1的活性。研究结果1.TSH能以剂量和时间依赖的方式促进HepG2细胞中脂肪酸和甘油三酯的聚积,还能明显抑制HepG2细胞中的脂肪酸氧化。2.TSH能显著改变肝细胞中多种miRNAs在线粒体中的分布,而不影响它们在细胞中的总表达量。这些miRNAs共有84个,其中69个在线粒体中的含量减少。PCR绝对定量和原位杂交实验进一步证实了其中代表性miRNAs（miR-449a、miR-449b-5p和miR-5194）的分布变化是从线粒体转运到胞浆。3.miR-449a、miR-449b-5p和miR-5194的潜在靶基因与多个脂代谢功能和信号通路密切相关,如脂肪酸氧化、PPARα介导的脂质代谢、NAFLD疾病发生和脂肪因子信号通路等。通过对潜在靶基因的结合能以及序列保守性等参数进行综合评估,我们推测PGC1B、ABCD1 和 ADIPOR1 分别是 miR-449a、miR-449b-5p 和 miR-5194 最可能的靶基因,双荧光素酶报告基因实验也证实了这一结果。同时,这三个miRNA mimics也能分别显著抑制HepG2细胞中上述靶基因的表达。4.miR-449a、miR-449b-5p和miR-5194显著促进HepG2细胞中甘油三酯聚积在HepG2细胞中分别转染miR-449a、miR-449b-5p和miR-5194能显著增加甘油三酯的聚积;而同时转染上述miRNA mimics及其相应靶基因的表达载体,则能明显减轻这些miRNA引起的甘油三酯沉积。转染miRNA inhibitors对HepG2细胞中甘油三酯沉积的影响不大。5.miR-449b-5p能显著上调HepG2细胞中VLCFA水平,共转染miR-449b-5p及其靶基因ABCD1的表达载体,则能显著抑制miR-449b-5p的上述作用。6.miR-449a和miR-5194能显著抑制代谢调控的关键分子PPARα的表达,从而抑制肝细胞中的脂肪酸β-氧化,并且二者具有协同作用（1）在HepG2细胞中分别转染上述两种miRNA mimics,能显著抑制其靶基因和PPARα在mRNA和蛋白水平的表达;而当共转染miRNA mimics及其相应靶基因的表达载体时,miR-449a和miR-5194抑制PPARα表达的作用消失。而且,共转染miR-449a和miR-5194对PPARα表达的抑制作用比单独转染其中任何一个miRNA mimic 更显著。（2）miR-449a和miR-5194能单独和协同下调脂肪酸β-氧化关键酶CPT1A和ACOX1的表达,抑制脂肪酸氧化,从而增加HepG2细胞中脂肪酸的水平。过表达PPARα可以减弱miR-449a和miR-5194的上述作用。7.miR-449a和/或miR-5194 inhibitor能明显减弱TSH对脂肪酸氧化的抑制作用转染miR-449a和/或miR-5194 inhibitor能显著增加脂肪酸β-氧化关键酶CPT1A和ACOX1的表达,增强线粒体和过氧化物酶体的脂肪酸氧化,减少HepG2细胞中脂肪酸的水平,从而减弱TSH对HepG2细胞脂肪酸β-氧化的抑制作用。结论1.TSH能明显改变HepG2细胞中多种miRNAs的线粒体-胞浆分布,而不影响它们在细胞中总的表达水平。2.miR-449a/449b-5p/5194作为上述miRNA的典型代表,它们在线粒体和胞浆中的分布变化在TSH诱导的甘油三酯聚积中发挥重要作用,而且这一作用不需要改变它们在细胞中的总表达量。3.miR-449b-5p通过调节靶基因ABCD1的表达,增加HepG2细胞中VLCFA的积累。4.miR-449a和miR-5194分别通过它们的靶基因PGC1B和ADIPOR1以及下游分子PPARα组成的调控网络,抑制脂肪酸β-氧化,促进甘油三酯在HepG2细胞中的聚积。