背景恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, Ot)感染所致的一种自然疫源性疾病,广泛流行于亚洲太平洋沿岸约1300万平方公里的地区,全球每年约10亿人有感染恙虫病的风险。鼠类是主要贮存宿主,恙螨为传播媒介。我国属于恙虫病重点疫区之一。在我国,恙虫病原仅在北纬31°以南的广大地区流行,以夏季型为主。长江以北地区自1986年在山东首次发生流行以来,新疫区不断形成和扩散,流行季节主要为秋冬季。病原体的遗传变异、生态旅游的发展以及疾病流行强度和疾病负担的低估,成为恙虫病研究新的推动力。监测恙虫病流行特征的改变,探讨该病疫区迅速扩散和疫情变化的特征和影响因素,对丰富恙虫病的病原学、流行病学理论及该病的诊断和预防控制具有重要意义。目的本研究通过对秋冬型恙虫病新、老疫区之间宿主动物和媒介的种属构成和分布特点、Ot型特异性抗原编码基因的变异特点和规律以及恙虫病的人群流行和感染特征进行比较与分析,探讨秋冬型恙虫病疫区扩散的流行病学特征与机制,从而为恙虫病的流行趋势预测提供重要线索,为该病的预防控制和诊断治疗提供科学依据。材料与方法自山东省秋冬型恙虫病老疫区选取沂南县、沂水县,自新疫区选取新泰市、岱岳区、即墨市及胶南市为调查点。2010年9月至2012年3月,一年四季在各调查点捕获宿主动物,采集宿主动物脾脏、肝脏和耳内寄生恙螨,对宿主动物和恙螨进行种属鉴定并计数,计算宿主动物的带螨率和带螨指数。自动物脾(肝)脏和恙螨中提取基因组DNA,应用巢式PCR检测标本中的Ot DNA,对56kDa型特异性抗原(type-specific antigen, TSA)编码基因进行扩增并测序,与自Genbank中获取的参考序列建立数据库,采用Mega5.0软件进行序列比对,以neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型构建系统发生树。采用Lasergene7.1软件对Ot56kDa TSA核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析。采用BEAST1.7.4软件基于贝叶斯蒙特卡洛马尔科夫链(Bayesian Markov Chain Monte Carlo, MCMC)算法对Ot56kDa TSA编码序列进行进化遗传学分析,对序列的进化速率、分化时间、最近共同祖先时间(the time to the most recent common ancestor, TMRCA)和分子钟模型进行估计。计算宿主动物的Ot阳性率和恙螨的最小阳性率。对秋冬型恙虫病新、老疫区宿主动物、媒介的种属构成、Ot携带状况以及Ot TSA编码基因特征进行比较与分析。根据山东省疾病报告信息系统(Shandong Disease Report Information System, SDRIS)2006-2013年山东省恙虫病疫情数据,描述山东省恙虫病的人群分布特征和季节分布特征。自2010年1月至2011年12月,采集恙虫病病例急性期抗凝全血和自然脱落的焦痂标本,进行Ot DNA检测、型特异性扩增和TSA编码基因序列分析。2010年自调查点的监测医院选取恙虫病确诊病例进行感染特征的现况调查,对新、老疫区恙虫病的临床特征进行比较分析。采用Epidata3.1软件建立数据库,采用Excel和SPSS16.0软件进行统计分析。结果1.宿主种属构成及感染状况在恙虫病新疫区捕获小兽类1158只,包括褐家鼠(58.4%)、黑家鼠(16.3%)、小家鼠(24.2%)、黑线姬鼠(0.7%)、大仓鼠(0.2%)和鼩鼱(0.3%)。褐家鼠是新疫区的四季优势鼠种,其次为小家鼠和黑家鼠。在恙虫病老疫区捕获小兽类736只,包括褐家鼠(50.5%)、黑家鼠(0.7%)、小家鼠(19.7%)、黑线姬鼠(14.8%)、黑线仓鼠(11.4%)、灰仓鼠(1.2%)和鼩鼱(1.6%)。褐家鼠是该地区春、夏、秋季的优势鼠种,黑线姬鼠是冬季的优势鼠种。山东省恙虫病新疫区室内宿主动物Ot的检出率为2.4%,其中褐家鼠和小家鼠的携带率分别为1.1%和5.2%。春、夏、秋、冬四季捕获鼠的Ot携带率分别为2.9%、0、3.3%和1.1%。该地区野外仅自秋季褐家鼠中检测到Ot。山东省恙虫病老疫区室内宿主动物Of的检出率为0.7%,其中褐家鼠和小家鼠的携带率分别为0.7%和1.1%。春、夏、秋、冬四季捕获鼠的Ot携带率分别为0.6%、0、2.5%和0。该地区野外仅在秋季捕获的褐家鼠和黑线仓鼠发现Of自然感染,携带率分别为2.3%和9.0%。2.媒介种属构成分布及感染状况在山东省恙虫病新疫区检获恙螨3属7种,包括居中纤恙螨、须纤恙螨、小盾纤恙螨、泰山纤恙螨、临淮岗纤恙螨、太平洋无前恙螨和巨螯齿恙螨,其中巨螯齿恙螨和太平洋无前恙螨是夏季的优势螨种,须纤恙螨、居中纤恙螨和小盾纤恙螨为秋冬季节的优势螨种。自山东省恙虫病新疫区室内捕获的3种宿主动物中,以褐家鼠带螨率和恙螨指数最高,分别为20.8%和8.72,其次为小家鼠(12.9%和3.77)。新疫区野外宿主动物的带螨率和恙螨指数分别为7.7%和0.54。在老疫区检获的恙螨有3属7种,包括泰山纤恙螨、须纤恙螨、小盾纤恙螨、居中纤恙螨、宽板纤恙螨、八毛背展恙螨和太平洋无前恙螨,其中八毛背展恙螨和太平洋无前恙螨是夏季的优势螨种,须纤恙螨和小盾纤恙螨为秋冬季节的优势螨种。自山东省恙虫病老疫区室内捕获的宿主动物中,以褐家鼠带螨率和恙螨指数最高,为17.1%和2.89,其次为小家鼠(10.6%和1.00)。老疫区野外宿主动物的带螨率和恙螨指数分别为11.9%和1.53。在野外捕获的5种宿主动物中,以黑线姬鼠的带螨率和恙螨指数最高,为22.1%和3.74,其次为褐家鼠(22.0%和2.17)、黑线仓鼠(3.2%和0.03)和小家鼠(2.0%和0.02)。研究自山东恙虫病新疫区室内宿主动物体表检获的居中纤恙螨、小盾纤恙螨、须纤恙螨、泰山纤恙螨和临淮岗纤恙螨中发现Ot的自然感染。Ot在室内动物体表恙螨中的最小阳性率为0.8%,其中泰山纤恙螨中Ot的最小阳性率最高为6.3%,其次是临淮岗纤恙螨(3.2%),居中纤恙螨(1.2%),小盾纤恙螨(0.7%)和须纤恙螨(0.6%)。自新疫区野外宿主动物体表寄生的恙螨中,发现小盾纤恙螨存在Ot的自然感染,最小阳性率为14.3%。自山东恙虫病老疫区室内宿主动物体表检获的居中纤恙螨、小盾纤恙螨、须纤恙螨和泰山纤恙螨中发现Ot的自然感染。Ot在室内动物体表恙螨中的最小阳性率为1.7%,其中泰山纤恙螨中Ot的最小阳性率最高为5.5%,其次是小盾纤恙螨(1.9%)、须纤恙螨(1.8%)和居中纤恙螨(1.3%)。自老疫区野外宿主动物体表寄生的须纤恙螨和泰安纤恙螨中发现存在Ot的自然感染,最小阳性率分别为5.0%和3.8%。3.宿主和媒介中恙虫病东方体基因特征与分布基于Ot56kDa TSA编码基因的系统进化分析显示,山东省恙虫病新疫区室内宿主动物和恙螨中自然感染的Ot基因型别呈现多样性,包括KWS1-4、SKS、FJS、SDM1和SDM2共8种基因型,其中宿主动物和恙螨中的主要Ot流行株为类Kawasaki型。研究自新疫区褐家鼠中发现KWS1、KWS2和KWS4型Ot的自然感染,自黑线仓鼠中发现KWS1型Ot的自然感染,自小家鼠中发现KWS2、KWS3、FJS、SDM1和SDM2型Ot的自然感染,自小盾纤恙螨中发现KWS1型Ot的自然感染,自须纤恙螨中发现KWS2和SKS型Ot的自然感染。山东省恙虫病老疫区宿主动物和恙螨中流行的Ot基因型别较为单一,存在KWS1和KWS2两种基因型Ot,其中自黑线姬鼠、褐家鼠和小家鼠中发现KWS2型Ot自然感染,自须纤恙螨、居中纤恙螨和泰山纤恙螨中发现KWSl型Ot自然感染。序列同源性分析显示,KWS1-4型与日本Kawasaki株的核苷酸序列同源性依次为96.6%、96.5%、96.1%和95.8%,氨基酸序列同源性依次为92.1%、91.7%、91.2%和91.2%；SKS型与日本Shimokoshi株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.3%和99.2%；FJS型与日本Fuji株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%和92.5%。新疫区宿主动物和恙螨间Ot流行株的核苷酸序列同源性为69.6%-100%,氨基酸序列同源性为53.8%-100%；老疫区宿主动物与恙螨间Ot流行株的核苷酸序列同源性为99.7%-99.9%,氨基酸序列同源性为99.2%-99.6%。新疫区Ot流行株的变异程度显著高于老疫区。BEAST进化遗传学分析结果显示,Ot56kDa TSA编码基因进化速率为1.15×10-4s/s/y (nucleotide substitution per site per year,95%HPD:5.75×10-6-2.52×00-4s/s/y)。分子钟系统进化树显示,KWS1-4型与日本Kawasaki型位于同一进化分支,此分支大约在679年前与其他分支分化,以较高的进化速率进化,而后进化速率逐渐减慢。KWS1型分化时间约为1934年,KWS2型分化时间约为1968年,KWS3和KWS4型分化时间为1990年。SDM1和SDM2型所在分支自2552年前分化以来,一直以较低的进化速率进化,SDM1与SDM2的分化时间为1983年。FJS型与日本Shimokoshi型位于同一进化分支,SKS型与日本Shimokoshi型位于同一进化分支,这两个分支自1061年前分化以来,分别以中等和较高的进化速率进化。4.恙虫病人群流行与感染特征据山东疾病报告信息系统的监测结果显示,山东省恙虫病疫情已波及临沂、泰安、日照、青岛、莱芜、潍坊、烟台、淄博、威海、济南、枣庄、滨州、济宁、聊城14个地(市),约占全省80%的广大地区,年发病率由2006年的0.23/10万上升至2013年的0.65/10万。山东省恙虫病新、老疫区易感人群均为农民,40-69岁发病人数占总发病数的65%以上。老疫区全年各月份均有病例报告,发病高峰为10-11月,5月份发病呈现小高峰,报告病例数总计22例。新疫区在2月和5-12月有病例报告,发病高峰为10-11月,5月份报告病例数总计12例。快速免疫层析法证实老疫区存在春季、新疫区存在夏季恙虫病感染病例。两类病人的临床表现均以发热、焦痂或溃疡、皮疹和疲乏为主,各项实验室检查指标差异无统计学意义,而头痛(P=0.013)、肌肉酸痛(P=0.032)、肝区叩痛(P=0.022)和并发症(P=0.008)的发生率存在显著性差异。两类疫区人间流行Ot株的优势基因型为KWS1和KWS2型,与日本Kawasaki型核苷酸序列同源性≥96.5%。研究首次发现Sdu-2型感染病例,并发现Sdu-2与KWS2两种基因型的复合感染。结论1.山东省恙虫病新、老疫区宿主动物和媒介的种属构成结构相似,亦存在一定差异。山东省恙虫病疫区褐家鼠中存在KWS1、KWS2、KWS4型Ot自然感染,小家鼠中存在KWS2、KWS3、FJS、SDM1和SDM2型Ot的自然感染,须纤恙螨中存在KWS1、KWS2和SKS型Ot的自然感染。不同的Ot基因型对宿主动物和恙螨具有较广泛的适应性和低选择性。相似的疫源地构成要素和Ot对宿主动物和恙螨广泛的适应性和低选择性可能是秋冬型恙虫病疫区扩散的重要因素。2.山东省恙虫病新疫区宿主动物和恙螨中Ot基因型别多样,存在KWS1-4、 SKS、FJS、SDM1、SDM2共8种基因型；老疫区宿主动物和恙螨中Ot基因型别较单一,存在KWS1和KWS2两型。两类疫区宿主动物和恙螨中流行的Ot优势基因型均为类Kawasaki型,Ot核苷酸序列同源性为70.0%-100%。3.血清学证实山东省秋冬型恙虫病疫区存在春季感染病例,并且自当地的春季宿主动物和恙螨中发现Ot的自然感染,提示在山东地区春季具备恙虫病流行的必要条件,正在或已经形成春季恙虫病传播链。4.自家鼠和家鼠体表寄生的恙螨中发现Ot的自然感染。除野鼠外,家鼠可能在秋冬型恙虫病的传播中发挥着重要作用。山东省恙虫病老疫区的疾病传播链可能以野鼠型为主,而新疫区的传播链以家鼠型为主。5.秋冬型恙虫病疫区扩散迅速,流行强度呈上升趋势。新、老疫区恙虫病的人群分布特征与季节性特征相似,人间Ot流行株优势基因型均为KWS1和KWS2型。首次发现Sdu-2与KWS2两种基因型Ot的复合感染病例。两类疫区的恙虫病病例在某些临床症状、体征和并发症的发生率方面存在显著性差异。