糖作为生命有机体的重要能量和物质来源,在植物生长发育及逆境胁迫响应调控中具有重要的作用。逆境胁迫下,植物通过调节体内糖的分配,维持细胞的渗透势、氧化还原水平等的平衡;糖还作为信号分子调控逆境相关基因的转录,从而提高植物对逆境的抵御能力。冷驯化作用诱导茶树中糖的积累,与茶树抗寒能力的提高密切相关。然而,糖的代谢、运输和信号转导受大量酶的调控,从酶学水平上研究糖在茶树抗寒中的作用机制困难较大。前期的研究发现碳水化合物相关基因在茶树冷驯化过程中的表达差异显著。因此,从基因水平上研究糖相关的酶基因的表达调控,有助于进一步揭示糖介导的茶树抗寒响应机理。本研究首先分析了冷驯化作用对茶树中主要糖含量等的影响;其次克隆了茶树中糖代谢、转运及信号转导相关的基因,共72个,对它们的生物信息学进行了详细的分析,并用荧光定量PCR(q RT-PCR)研究了它们在茶树自然冷驯化中的表达模式。为揭示糖介导的茶树抗寒机制研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.冷驯化过程中,茶树中的淀粉含量降低,蔗糖、葡萄糖等可溶性糖含量升高,同时脯氨酸和丙二醛等也发生改变,茶树抗寒能力的提高。电镜观察显示,冷驯化对茶树叶绿体结构的影响较明显。淀粉代谢、蔗糖代谢等通路与茶树冷驯化密切相关。2.淀粉代谢与植物抗寒响应密切相关。在淀粉代谢途径中,克隆了茶树中2个淀粉合成酶基因(Cs SS3和Cs SS4)、9个β-淀粉酶家族基因(Cs BAM1-9)、3个α-淀粉酶家族基因(Cs AMY1-3),以及麦芽糖转运蛋白Cs MEX1基因和麦芽糖转葡萄糖基酶Cs DPE2基因。分析了它们的生物信息学特征,荧光定量PCR检测了这些基因在茶树自然冷驯化中的表达模式。冷驯化调控茶树中淀粉代谢相关基因表达,提高β-淀粉酶活性变化。克隆了1 515 bp的Cs BAM3启动子区,分析显示含多种逆境响应元件,并对Cs BAM3进行了原核表达分析。3.逆境胁迫下,可溶性糖,如蔗糖、海藻糖和RFO等含量提高能够保护植物免受胁迫的伤害。在他们的合成通路中,克隆了28个基因。分析了这些基因编码的蛋白质理化性质、蛋白质高级结构和系统发育等生物信息学特征。基因表达显示,糖代谢的基因受低温诱导,特别是Cs INV5等能够被显著上调表达。克隆了茶树Cs INV5启动子区930 bp的序列,分析显示其含有低温等胁迫响应的元件。4.糖的分配受糖转运蛋白的调控,从而影响植物对逆境的响应。我们从茶树中克隆了包括SUTs、ERD6-like、SWEETs、TMTs等7种不同类型的糖转运蛋白基因20个。生物信息学分析显示,它们均含有糖转运蛋白典型的跨膜螺旋结构。冷驯化过程中,大部分转运蛋白基因上调表达,参与糖输出的转运蛋白基因的表达被抑制,它们可能调控了低温驯化中糖的分配。5.己糖激酶(HXK)和蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(Sn RK1)是植物糖信号转导途径中的重要调控元件,我们在茶树中分别克隆3个HXK基因(Cs HXK1-3)和3个Sn RK1基因(Cs Sn RK1.1-1.3),同时还分离了Cs Sn RK2.6和Cs Sn RK2.8两个逆境胁迫响应基因。在冷驯化过程中,Cs HXK3、Cs Sn RK1.2和Cs Sn RK2.8的表达显著上调,Cs HXK2、Cs Sn RK1.3和Cs Sn RK2.6的表达被抑制,而Cs HXK1和s Sn RK1.1的表达变化不显著。克隆了Cs HXK3上游2 538 bp的启动子序列片段,分析显示含多个低温响应元件以及多种逆境响应相关的元件。