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细胞自噬(autophagy)是以细胞质空泡化为特征的溶酶体依赖性的降解途径。细胞自噬通过清除损伤的细胞器和错误折叠的蛋白,从而维持细胞结构和功能的稳定以及在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等过程中发挥重要作用。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度为200bp~100kb的RNA,曾一度被认为是“转录噪音(transcriptional noise)”或“暗物质(Dark Matter)”。最近研究显示,lnc RNA在肿瘤发生发展、细胞增殖凋亡以及自噬调控中发挥重要功能。lnc RNA UCA1(Urothelial carcinoma associated 1)最初是在人膀胱癌细胞中被发现,并且被证实参与了多种肿瘤的生长和转移,然而其在结肠癌中的研究报道较少。UCA1与细胞自噬的关系以及能否通过调控细胞自噬影响结肠癌细胞的增殖凋亡有待进一步探究。因此,本研究通过分析UCA1与细胞自噬的关系,探讨UCA1调控细胞自噬对结肠癌细胞的增殖凋亡的影响,为阐明UCA1在细胞自噬以及结肠癌中的作用奠定基础。主要研究内容:1.UCA1对细胞自噬及AKT/m TOR信号通路的影响用LPS(终浓度1μg/m L)分别处理293T细胞0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,q PCR检测UCA1以及自噬相关基因LC3、AKT、m TOR的表达,并利用SPSS软件分析其相关性;同时用浓度为50 n M的si-UCA1和si-NC转染293T细胞24 h,q PCR和Western Blot技术检测自噬相关基因LC3、ATG3与p62以及AKT、m TOR的表达。结果显示,UCA1和LC3表达量在4 h和6 h显著上调,而AKT和m TOR表达量在4 h和6 h显著下调,同时发现UCA1与AKT和m TOR呈显著性负相关,与LC3呈显著正相关;并且下调UCA1,p62、AKT、m TOR显著上调,而LC3与ATG3显著下调,表明下调UCA1可以抑制细胞自噬。2.UCA1对miR-23a表达的影响利用生物信息学分析UCA1与miR-23a的结合位点,miR-23a mimics/mimics NC、miR-23a inhibitor/inhibitor NC分别转染293T细胞,q PCR检测UCA1的表达;同时将si-UCA1和si-NC分别转染293T细胞,q PCR检测Pri-miR-23a、Pre-miR-23a、Mature miR-23a的相对表达量。结果发现,UCA1与miR-23a具有结合位点且呈负相关,同时发现下调UCA1,只有Mature miR-23a的相对表达量发生显著升高。表明UCA1与miR-23的表达呈负相关并参与其转录后的调控。3.UCA1对293T细胞增殖凋亡的影响转染si-UCA1和si-NC于293T细胞,并用LPS处理细胞。通过CCK-8实验和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡和周期。结果发现,与对照组相比,下调UCA1使细胞增殖水平在4 d-5 d显著下降,凋亡水平显著增加并且细胞周期发生G2期阻滞。表明下调UCA1,可以抑制LPS刺激下的细胞增殖,促进细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡。4.UCA1在结肠癌细胞中的表达及其对细胞自噬的影响q PCR检测UCA1在正常结肠上皮细胞NCM460以及几种结肠癌细胞系Lo Vo、HT-29、HCT-116、Caco-2的表达,并分别转染同浓度的si-NC、si-UCA1和si-UCA1+RAPA(自噬激活剂,100 nmol/L),24 h后Western Blot检测LC3蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,UCA1在结肠癌细胞中表达水平显著升高,尤其是Caco-2细胞;并且干扰UCA1后,LC3II蛋白显著下调,而RAPA能显著逆转LC3II蛋白的表达。这种现象表明下调UCA1可以抑制结肠癌细胞自噬的发生。5.UCA1调控细胞自噬对Caco-2细胞增殖凋亡的影响在Caco-2内,分别转染si-NC、si-UCA1、si-UCA1+RAPA以及si-UCA1+3-MA(自噬抑制剂,5 mmol/L),通过CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡与周期。结果显示干扰UCA1后,细胞增殖水平在4 d-5 d显著下降,凋亡水平显著增加并且细胞周期发生G2期阻滞,但是3-MA可以促进这种现象,而RAPA逆转这种现象。表明在Caco-2细胞内,下调UCA1可通过抑制细胞自噬,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡和细胞周期G2期阻滞。结论:UCA1与细胞自噬相关,并可能通过AKT/m TOR信号通路调控细胞自噬;UCA1可能在转录后水平参与miR-23a的表达调控;下调UCA1可以改变细胞的活性,并且通过调控结肠癌细胞自噬从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期G2期阻滞。