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鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种免疫抑制性肿瘤疾病。近年来出现很多MDV变异株且毒力有不断增强的趋势,突破了现有疫苗的免疫保护,给养禽业造成了极大的经济损失。RNAi技术已广泛运用于抗病毒研究,有研究表明gI和gE是MDV重要的糖蛋白基因,在促进病毒细胞间传递,毒力介导、Fc受体活性等方面发挥重要作用。因此,开展靶向gI和gE特异siRNA抑制病毒复制的研究对解析MDV体外增殖及水平传播机理具有重要的参考意义。首先为了开展禽源细胞RNAi研究,以鸡胚成纤维细胞(CEF)DNA为模板扩增禽源cU6-3启动子完整序列,在此基础上人工合成了分别针对gI、gE基因5个靶位点的10条下游引物,采用重叠PCR方法快速扩增含cU6-3启动子的shRNA表达盒。将其分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细胞,荧光显微镜定性观察结果显示siRNAs均能不同程度的抑制gI、gE基因的表达,流式细胞仪定量检测抑制融合蛋白表达的效率在8.5%～79.1%之间。将干扰效率最好的shRNA表达盒插入pGEM-T载体中构建shRNA重组质粒pcU6-shgI735和pcU6-shgE936,通过与报告质粒(pEGFP-gI或pEGFP-gE)共转染DF-1、MDCK、Vero细胞系,测定出不同细胞系gI和gE基因的抑制效率。接下来以含鼠源启动子的pEU6质粒为模板,按同样的方法构建pmU6-shgI735和pmU6-shgE936重组质粒,连同上述shRNA重组质粒一起共转染DF1、MDCK、Vero细胞,比较禽源U6和鼠源U6启动子的驱动siRNAs的转录活性。结果显示在DF-1细胞上禽源U6驱动特异性siRNA对gI、gE基因抑制率分别为87.39%和85.04%,其活性是哺乳动物细胞1.21～1.45倍,差异显著(p<0.05),并且在禽源细胞上转录活性高鼠源U6启动子1.08～1.13倍,表明在禽源细胞中禽源U6启动子可以代替其它来源U6启动子诱导特异性siRNA的表达;而鼠源U6启动子在哺乳动物细胞(猴源Vero、狗源MDCK)上转录活性是禽源U6启动子1.24～1.54倍,驱动的特异性siRNA沉默基因的效果显著优于禽源U6启动子(p<0.05)。充分反映了RNA聚合酶Ⅲ类启动子在哺乳动物和非哺乳动物细胞上的活性存在差异。为了进一步探讨RNAi技术在体外水平抑制MDV复制的可行性,构建稳定表达shRNA的真核表达载体pEU6-shgI735、pEU6-shgE936和串联表达载体pEU6-shgE936-shgI735。在表达载体转染CEF细胞后24h,用shRNA表达盒特异性引物,RT-PCR方法确定了siRNA的表达。用MDVL-ZY株感染转染后细胞,通过半定量RT-PCR、抑制病毒蚀斑形成试验及MTT保护试验分别检测转染细胞病毒含量中gI/gE基因表达量、MDV感染细胞中的PFU数量及特异性siRNA对病毒感染细胞存活率的影响。结果显示:与阴性对照组相比,pEU6-shgI735、pEU6-shgE936和pEU6-shgE936-shgI735真核表达载体抑制病毒gI表达率分别为77.33%、61.46%和83.15%;gE基因抑制率为59.93%、75.94%、80.97%;PFU空斑分别减少了78.57%、77.88%、83.64%。MTT试验检测结果也表明特异性siRNA对病毒感染的禽类细胞有良好保护性。以上试验结果表明,筛选到gI、gE基因抑制病毒特异性siRNA能显著抑制MDV糖蛋白基因的表达、MDV蚀斑的形成及病毒在CEF细胞上的增殖,为MDV复制机理的研究提供新线索及该病的防制提供了新思路,