【摘 要】
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转录调控因子HexR广泛存在于假单胞菌中,主要负责调控与葡萄糖的转运、分解代谢以及ED途径相关基因的表达;2-酮基-D-葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）由假单胞菌周质空间中的葡萄糖氧化途径产生,是食品抗氧化剂D-异抗坏血酸（钠）生产的关键中间体。变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01是目前国内2KGA发酵的工业生产菌株,本论文
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转录调控因子HexR广泛存在于假单胞菌中,主要负责调控与葡萄糖的转运、分解代谢以及ED途径相关基因的表达;2-酮基-D-葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）由假单胞菌周质空间中的葡萄糖氧化途径产生,是食品抗氧化剂D-异抗坏血酸（钠）生产的关键中间体。变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01是目前国内2KGA发酵的工业生产菌株,本论文以其为研究对象,采用PCR技术克隆转录因子HexR的基因,并利用一些相关的在线分析软件和工具对HexR蛋白进行生物信息学分析;利用大肠杆菌表达系统对克隆的基因进行表达,并对表达的蛋白进行分离纯化与鉴定;采用基因敲除技术敲除hexR基因并对其进行回补,通过发酵试验分析hexR基因的敲除对变形假单胞菌2KGA生物合成的影响。主要研究结果如下:（1）利用聚合酶链式反应技术,从P.plecoglossicida JUIM01中克隆了长度为873 bp的hexR基因,并成功构建了重组菌株Escherichia coli BL21（DE3）/p ET-28a（+）-hexR,提取重组质粒进行的测序验证结果正确。生物信息学分析结果表明:变形假单胞菌的HexR蛋白,由290个氨基酸残基组成,定位于细胞质中,没有跨膜区域,不含信号肽,是疏水性蛋白;HexR蛋白属于Rpi R超家族蛋白,理论分子质量（Mw）和等电点（p I）分别为31677.36 Da和6.60,有四种不同的蛋白修饰位点,其二级结构中无规卷曲（random coil）占25.17%,β-转角（beta-turn）占4.83%,延伸链（extended strand）占11.72%,α-螺旋（alpha-helix）占58.28%。（2）对构建的重组菌株E.coli BL21（DE3）/p ET-28a（+）-hexR进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDS-PAGE及Western-blot分析,其结果表明,该蛋白的分子质量大约为32.0 k Da,与利用生物信息学方法预测的HexR蛋白的理论分子质量相符。采用亲和层析、透析和超滤浓缩等方法,对HexR蛋白进行了分离纯化,得到了单一条带的重组HexR蛋白。利用LC-MSMS和MALDI-TOF-MS等对纯化的蛋白进行了鉴定,结果表明该蛋白即为HexR蛋白,其分子量大约为31.914k Da。（3）成功构建了hexR基因敲除菌株P.plecoglossicida JUIM01ΔhexR和回补菌株P.plecoglossicida JUIM01ΔhexR/p BBR1MCS-2-hexR,并对其在32℃和36℃条件下的发酵过程进行比较。结果显示:在发酵温度从32℃升高到36℃时,变形假单胞菌的葡萄糖代谢通量由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转,三个菌株的糖酸转化率均发生降低;在36℃培养下,三个菌株的细胞生长均受到抑制,但敲除菌株的细胞生长明显好于原始菌株和回补菌株,说明hexR基因的敲除有利于细胞的生长。
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