芫菁科昆虫因体内含有斑蝥素,而具有重要的药用价值,是一种传统中药材资源。随着斑蝥类药物在治疗皮肤病、水肿病、狂犬病及多种癌症的广泛应用,临床上对斑蝥素药源材料的需求量急剧增加。目前野生芫菁仍是药用斑蝥素及其衍生物的主要来源,而且野生芫菁资源有限和斑蝥素的人工合成条件苛刻。芫菁规模化人工养殖是解决斑蝥素资源短缺的主要途径,但因其特殊的复变态生活史和滞育时间较长特性,制约了该类昆虫资源的开发利用。扁角豆芫菁Epicauta impressicornis是我国西南常见种类,体内斑蝥素含量较高,是潜在斑蝥资源。本文以扁角豆芫菁为研究对象,探索不同温度下该虫的生长发育特性及滞育诱导条件,构建该虫全长参考转录组数据库,开展幼虫不同滞育阶段比较转录组分析并筛选滞育关联基因,克隆滞育关键基因并分析其表达特性,明确不同滞育阶段糖代谢物质的变化规律,初步鉴定滞育关键基因的功能,为下一步缩短其幼虫期,增加年繁殖代数,减少人工饲养周期提供参考。主要研究结果如下:1.不同温度下扁角豆芫菁生长发育特性及滞育诱导条件构建了不同温度（21、24、27、30、33和36℃）下扁角豆芫菁实验种群的生命表。结果显示,温度对扁角豆芫菁发育历期、存活率、繁殖力和种群生命表参数均有显著影响。经比较,饲养该虫的最佳温度策略为27至30℃。不同温光组合条件下滞育诱导实验表明,温度较光周期对扁角豆芫菁5龄幼虫的滞育诱导效能更显著,温度对滞育过程起主导作用。12℃温度可有效诱导5龄幼虫进入滞育和高于18℃时可有效延缓其进入滞育;而温度高于21℃时,5龄幼虫不发生滞育。研究结果为后续转录组取样提供依据。2.基于联合测序构建扁角豆芫菁全长参考转录组数据库通过Illumina Hi Seq X Ten和Pac Bio Sequel双平台对扁角豆芫菁6个生长发育时期共18个样品及其等量的混合样品进行测序分析,将获得的全长转录本与八大功能数据库进行比对注释。结果显示,共得到去冗余全长转录本序列信息28,276条;预测可变剪切事件1,380个、简单重复序列53,566个、编码蛋白框22,804个、长链非编码RNA 2,382个和转录因子51个;获得Nr数据库功能注释25,775条。研究结果丰富了扁角豆芫菁基因信息和为不同滞育阶段转录组分析提供数据支撑。3.扁角豆芫菁不同滞育阶段转录组特征以扁角豆芫菁全长转录组作为参考,对其幼虫不同滞育阶段转录组进行测序分析。结果显示,正常发育组与滞育组的差异表达基因（DEGs）有3,003个,滞育组与滞育解除组的DEGs有3,832个,滞育解除组与正常发育组的DEGs有589个;注释后获得滞育期有49个上调和7个下调基因。GO功能富集分析获得滞育组在维持其生命活动的生物学功能方面明显不同于非滞育组（正常发育组和滞育解除组）。KEGG通路富集分析发现脂肪酸生物合成和糖类代谢通路密切相关的淀粉和蔗糖代谢在调控滞育过程中具有重要作用。基于以上数据预测并筛选获得滞育关联基因共20个,采用qRT-PCR明确了19个基因的表达量变化趋势与转录组测序数据一致。同时,在5龄幼虫滞育的5个不同时间点比较了这些基因的表达量,获得13个基因在30d表达量较高,表明它们可能参与扁角豆芫菁滞育的调控。研究结果表明从转录水平探究扁角豆芫菁滞育发生具有重要意义。4.扁角豆芫菁Tret1、GD和SD基因的克隆及分析基于扁角豆芫菁筛选的滞育关联基因信息,运用PCR克隆海藻糖转运蛋白Tret1、葡萄糖脱氢酶GD和山梨醇脱氢酶SD基因,对其进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR分析它们的表达特性。结果显示,EPTret1、EPGD和EPSD基因全长分别为1,710bp、2,225bp和1,253bp,它们均无信号肽,但有磷酸化位点、糖基化位点和跨膜结构。它们的编码蛋白均存在1个保守结构域。EPTret1和EPGD蛋白的三级结构寡聚物类型为单体,而EPSD蛋白为同型二聚体,它们均有α-螺旋和β-折叠结构。EPTret1、EPGD和EPSD氨基酸序列分别与鞘翅目昆虫的Tret1、GD和SD同源序列的一致性为51.03%、69.84%和78.02%;在系统发育树中扁角豆芫菁的EPTret1、EPGD和EPSD分别与赤拟谷盗的TCTret1、TCGD和TCSD序列聚为一支,亲缘关系最近,这与传统昆虫分类观点一致。EPTret1和EPSD基因的表达量在胸部和脂肪体最高,而头部最低,EPGD基因的表达量在胸部最高和脂肪体最低;EPTret1、EPGD和EPSD基因的表达量均在5龄初幼虫最高。研究结果为深入探究EPTret1、EPGD和EPSD基因在扁角豆芫菁滞育过程中的作用提供依据。5.扁角豆芫菁不同滞育阶段糖代谢物质的变化规律采用蒽酮法和酶标法等对扁角豆芫菁5龄幼虫不同滞育阶段进行糖代谢物质测定,并利用qRT-PCR对Tret1、GD和SD基因及在不同滞育阶段的糖代谢相关的基因进行表达解析。结果显示,扁角豆芫菁滞育组的海藻糖含量和山梨醇含量极显著高于正常发育组,糖原含量极显著低于正常发育组,而葡萄糖含量在96h极显著高于正常发育组和48h无显著差异;滞育解除组的海藻糖和糖原含量高于正常发育组,而山梨醇含量在48h显著高于正常发育组,而96h略低无显著差异,葡萄糖含量较正常发育组的在48h略高但96h较低。正常发育组的海藻糖酶活（TRE1和TRE2）在不同时间点变化不大,而滞育组和滞育解除组的TRE1和TRE2酶活分别呈逐渐略有升高和逐渐降低趋势。以上结果表明在滞育期间扁角豆芫菁5龄幼虫主要积累海藻糖和山梨醇,糖原可能转化为海藻糖和山梨醇。在不同滞育阶段的Tret1、GD和SD基因表达量存在明显的差异。不同滞育阶段糖代谢（海藻糖代谢、山梨醇代谢和其他糖代谢）过程中相关基因的相对表达量各不相同,表明不同滞育阶段的糖代谢过程是多基因多维度调节的复杂过程。研究结果为阐释扁角豆芫菁滞育分子机理和鉴定滞育关键基因的功能提供生理代谢方面的参考资料。6.扁角豆芫菁Tret1、GD和SD基因的功能鉴定通过RNAi显微注射法鉴定了扁角豆芫菁Tret1、GD和SD基因在不同滞育阶段的生物学功能。结果显示,注射dsTret1、dsGD和dsSD后,相应的目的基因转录水平在不同滞育阶段均降低,尤其在滞育组均为极显著降低,说明在试虫滞育阶段可有效抑制Tret1、GD和SD基因表达。与对照组dsGFP相比,5龄幼虫不同滞育阶段表型特征（自身体型、体色和活动力）均有所变化;试虫不同滞育阶段的海藻糖、糖原、葡萄糖和山梨醇含量及海藻糖酶活性变化均各自存在差异,其中在滞育组表现较为明显;糖代谢（海藻糖代谢、山梨醇代谢和其他糖代谢）过程中相关基因在不同滞育阶段的相对表达量均各不相同。表明Tret1、GD和SD基因对扁角豆芫菁滞育发生过程中具有重要作用;扁角豆芫菁滞育过程中关键的糖代谢是由多基因多维度介导的。研究结果为Tret1、GD和SD基因调控扁角豆芫菁滞育提供了主要线索,有助于从分子生物学角度为调控扁角豆芫菁滞育的靶标基因提供科学依据。