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目的:采用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)技术,分析不同牙周状态下龈下微生物群落的构成特征、牙龈/肿瘤组织TCRβ链CDR3组库的异质性及其与口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)发生间可能存在的关系,以期为OSCC的发生机制与防治提供新的思路与依据。方法:根据诊断与纳入标准,收集相关病例共15例为研究对象,将研究对象分为三组:5例中重度慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)伴OSCC(牙龈部位)患者、5例中重度CP患者、5例牙周健康者,分别命名为:T、C、H组;其中细菌按取样部位不同,可分为龈下菌斑组(bp组)和牙龈组织组/OSCC肿瘤组织组(g组);记录研究对象基本信息情况(性别、年龄)与牙周临床指标(探诊深度、牙周附着水平、探诊出血);在15名研究对象的手术区域对应牙位或拔牙牙位进行龈下菌斑取样,并采集对应牙位的局部牙周组织(牙龈组织/牙龈鳞癌肿瘤组织)两份,-80℃冰箱冻存;将各样本送往华大基因科技公司(中国武汉),经质检合格后,三组的龈下菌斑(bp组)及牙龈/肿瘤组织(g组)提取DNA,PCR扩增16S r DNA V4区域,采用Hi Seq2500进行测序;而三组用于免疫组库测序的牙龈/肿瘤组织提取RNA,采用Hiseq4000平台进行免疫组库测序。从武汉华大基因公司获得测序原始数据,采用IMGT/High V-QUEST平台(www.imgt.org)、QIIME、Mothur、VDJtools等软件分析龈下菌斑及局部牙周组织内微生物群落结构特征及多样性,分析各样本中TCRβ链CDR3组库的组成、TRBV和TRBJ基因家族的取用和配对、CDR3组库的多样性(chao1指数、chao E指数、香农指数)等。结果:1.三组患者龈下菌斑和牙龈/肿瘤组织中微生物OTU venn图分析发现,H、C、T组有大量核心物种共同定植。而龈下菌斑物种多样性的分析显示,C-bp组患者龈下菌群的多样性高于H-bp组(P<0.05),T-bp组患者龈下菌群的多样性低于H-bp组(P<0.05);牙龈/肿瘤组织中物种多样性的分析显示,H-g组牙龈组织中微生物多样性最高,C-g组次之,T-g组最低,但差异无统计学意义(P>0.05);此外,H、C、T三组均为牙龈/肿瘤组织内微生物多样性略高于龈下菌斑,无显著差异(P>0.05)。2.在门水平上,对三组患者龈下菌斑及牙龈/肿瘤组织中共有优势菌门微生物的组间相对丰度统计分析表明:C-bp组梭杆菌门高于T-bp组(P<0.05),T-bp组变形杆菌门高于C-bp组(P<0.01),C-bp组螺旋体显著大于T-bp组(P<0.05),C-bp组、H-bp组、T-bp组梭杆菌门和螺旋体相对丰度的降低具有统计学意义;H-g组梭杆菌门显著大于C-g组及T-g组(P<0.05),T-g组变形杆菌门高于H-g组(P<0.05),T-g组、C-g组、H-g组变形杆菌门相对丰度的降低具有统计学意义;H、C、T组内牙龈/肿瘤组织和龈下菌斑进行门水平差异性比较:H-bp组变形杆菌门高于H-g组(P<0.01),C-bp组梭杆菌门高于C-g组(P<0.01),T-bp组各菌门与T-g组无显著差异。3.在属水平上,T组独特的优势菌属有:假单胞菌属、消化链球菌属、颗粒链菌属,其中,T-bp组消化链球菌属及颗粒链菌属显著大于C-bp组(P<0.05);C组独特的优势菌属为:产线菌属,C-bp组产线菌属显著大于T-bp组(P<0.05);H组独特的优势菌属有:乳杆菌属、巨球型菌属,但无显著差异。H、C、T组间共有优势菌属组间相对丰度水平进行差异性比较:T-bp组链球菌属显著大于C-bp组(P<0.05),C-bp组密螺旋体属显著大于T-bp组(P<0.05),C-bp组普雷沃菌属显著大于H-bp组(P<0.05);T-g组二氧化碳噬纤维菌属显著大于H-g组(P<0.05),H-g组戴阿李斯特杆菌属显著大于C-g组(P<0.05);H、C、T组内牙龈/肿瘤组织和龈下菌斑进行属水平差异性比较显示:C-bp组梭杆菌属(P<0.01)和普雷沃菌属(P<0.05)显著大于C-g组,H-bp组戴阿李斯特杆菌属显著小于H-g组(P<0.05),H-bp组奈瑟菌属显著大于H-g组(P<0.05),T-bp组各菌属与T-g组无显著差异。4.在种水平上,各组间物种相对丰度水平进行差异性比较:T-bp组中婴儿链球菌显著高于C-bp组(P<0.05),T-g组中小韦荣球菌显著小于H-g组(P<0.05),T-g、C-g、H-g组中小韦荣球菌的降低具有统计学意义;C-bp组中索氏密螺旋体和产黑色素普雷沃菌显著大于H-bp组(P<0.05);H-g组中变黑普雷沃菌显著大于T-g组(P<0.05)。5.牙龈/肿瘤组织样本中微生物物种与环境因子(PD、AL、BOP)冗余分析表明:假单胞菌属、消化链球菌属、颗粒链菌属、婴儿链球菌、Prevotella nanceiensis与各环境因子间的夹角为锐角,呈正相关关系;变黑普雷沃菌、小韦荣球菌与各环境因子间的夹角为钝角,呈负相关关系。6.三组牙龈/肿瘤组织样本中CDR3组库的多样性分析:C组患者中TCRβ链CDR3组库多样性高于H组,T组多样性最低,但无统计学意义;三组均存在高度保守的氨基酸(amino Acids,AA)基序“YEQY”和“ETQY”,并且在H组出现的频率最高,这可能与环境中共同抗原表位刺激有关;在T组中发现独特保守的AA基序“NEQF”,该基序在H、C组中未发现。7.三组牙龈/肿瘤组织样本中CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族及V-J配对取用分析:(1)H、C、T三组共同高频取用的TRBV基因家族为TRBV2和TRBV20-1,三组间比较具有显著差异(P<0.05);T组对TRBV5-1、TRBV2基因家族的取用频率较H组显著升高(P<0.05),T组对TRBV2基因家族的取用频率较C组显著升高(P<0.05)。(2)H、C、T三组共同高频取用的TRBJ基因家族为TRBJ2-7、TRBJ2-5、TRBJ1-1、TRBJ2-2、TRBJ1-2,三组间比较无显著差异(P>0.05);(3)H、C、T三组共同的优势配对(>1%)基因包括:TRBV20-1-TRBJ2-7、TRBV20-1-TRBJ2-5、TRBV2-TRBJ2-7、TRBV29-1-TRBJ1-1、TRBV28-TRBJ2-7。8.三组牙龈/肿瘤组织样本中CDR3 AA取用和长度分析:H、C组呈钟型分布,以13-15个AA长度为主,而T组主要以14-15个AA长度取用居多。9.三组牙龈/肿瘤组织样本中CDR3组库中AA重叠序列:H组及C组的样本中均未见重叠的AA序列,T组的样本中有5条重叠的AA序列。结论:1.H、C、T三组的龈下菌群构成各不相同,三组各自具有其独特的优势菌群,且物种的组成具有显著的差异。2.中重度CP患者龈下菌斑中消化链球菌属及颗粒链菌属的增加可能与OSCC的发生、发展相关。3.H、C、T三组牙龈/肿瘤组织TCRβ链CDR3组库中,T组的CDR3组库多样性低于C组和H组,但其多样性差异不显著。TRBV2基因的取用、部分TRBJ基因的取用及TRBV-TRBJ基因配对取用出现明显的改变,表明龈下菌斑的微生物组成可能影响牙龈/肿瘤组织中TCRβ链CDR3组库的组成,这可能与不同牙周微环境的免疫反应存在相关性。