研究背景乳腺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,目前已经成为全世界女性生命健康的主要威胁,尽管我们在乳腺癌的早诊早治上取得了一些进展,但每年仍有约50万的女性死于乳腺癌。在我国,乳腺癌近10年的发病率增加了 30%,其发病率已跃居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌严重影响了女性的身心健康,甚至危及生命。因此,明确乳腺癌的发病机制、寻找合适的治疗靶点及制定合理有效的治疗策略成为目前乳腺癌研究的重点。机体的正常发育及内环境的稳定,是由细胞生存与凋亡间的平衡共同维持的,在这一过程中,各种不同的生长因子介导的细胞信号转导通路起着非常重要的调控作用。随着人们对细胞恶性生物学行为的研究深入,人们开始认识到在信号转导过程中,通路蛋白的磷酸化与去磷酸化修饰是信号通路调控的重要方式,两者之间的平衡调控细胞的生长、增殖、凋亡等过程。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)催化酪氨酸磷酸化,而蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)催化磷酸化酪氨酸去磷酸化,从而发挥磷酸化的调控作用。在乳腺癌的发生发展中存在着酪氨酸磷酸酶活性降低及/或酪氨酸激酶活性增强,从而导致细胞内磷酸化水平的失衡。受体酪氨酸激酶是最大的一类酶联受体,其中研究最热的是表皮生长因子受体家族(也称为HER家族),包括HER1(EGFR)、HER2、HER3、HER4。HER家族受体在细胞膜上以无活性单体存在,一旦与配体结合,便可彼此结合形成10种不同的同源二聚体或异源二聚体。二聚体之间相互激活它们的蛋白激酶功能,进而激活多种不同的细胞信号转导途径,导致细胞增殖、分化、转移等。HER家族的磷酸化和去磷酸化平衡在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,尤其是HER2分子。在乳腺癌患者中,20%～25%的患者存在HER2的高表达,这些HER2高表达的乳腺癌恶性程度高,易转移复发,患者预后差。目前,针对HER家族的抗肿瘤分子靶向药物主要是小分子抑制剂(吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼)和单抗类(曲妥珠单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗等)。虽然酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的临床应用取得了令人鼓舞的疗效,但是多数治疗有效的患者在一年内出现耐药。我们原有的药物是以阻断PTK为原则设计的,对PTP的关注过少。那么在以PTK为靶点的药物出现耐药、治疗遇到瓶颈的时候,是否可以通过调控PTP来达到纠正细胞内酪氨酸的过度磷酸化、使细胞维持自身稳定的目的呢?在目前已分离纯化的PTP家族成员中,含SH2结构域的SHP-1(SH2-domain-containing protein-tyrosine phosphatase-1,酪氨酸磷酸酶-1)基因是近年来发现的一个重要候选抑癌基因。SHP-1蛋白在多种肿瘤中呈低表达,是细胞信号转导通路中的负性调节蛋白;它能使蛋白酪氨酸激酶去磷酸化,从而抑制肿瘤生长。课题组前期研究发现,乳腺癌MDA-MB-231细胞株转染SHP-1基因后,肿瘤细胞的增殖能力受到抑制;瞬时干扰MCF-7细胞株中的SHP-1基因后,肿瘤细胞的迁移能力明显增强。但SHP-1在乳腺癌细胞恶性生物学行为中的具体作用机制目前仍不十分清楚,相应的调控通路也尚未明确。原有的研究表明MAPK(Mitogen-activated protein kinase,丝裂素原活化蛋白激酶)信号通路在乳腺癌的发生、发展中通常被激活。MAPK家族信号通路主要包括 Erk1/2(Extracellular regulated protein kinase 1/2,细胞外调节蛋白激酶1/2)、JNK(c-JunN端激酶)和p38MAPK三个成员。多种小分子物质均可以通过MAPK信号通路来调节乳腺癌的增殖、侵袭和转移等生物学功能。那么MAPK信号通路是否参与了 SHP-1对乳腺癌的调节作用呢?如若参与,是主要通过哪个家族成员发挥作用的呢?其下游通路又是怎样的呢?这些问题我们都将在本课题中进行探讨。在本课题中,我们先在人乳腺癌组织中检测SHP-1蛋白的表达情况,并结合各项临床病理特征、总生存期做统计分析;再通过慢病毒感染或RNA干扰的方法改变SHP-1的表达,从而再次探讨SHP-1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并在裸鼠乳腺癌模型上加以验证,最后通过Western blot实验探究其具体的分子机制。研究目的1.研究SHP-1在乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理特征间的相关性,并分析SHP-1对乳腺癌患者总生存期的影响;2.探讨SHP-1对乳腺癌细胞增殖的影响及其分子机制;3.探讨SHP-1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。研究内容和方法1.SHP-1在乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理特征间的相关性1)免疫组化方法检测乳腺癌组织及癌旁组织中SHP-1的表达情况;2)结合乳腺癌组织的临床资料,应用统计学方法,分析SHP-1的表达与乳腺癌临床病理特征间的相关性;3)分析SHP-1表达与乳腺癌患者预后的关系,并进行多元回归分析。2.SHP-1对乳腺癌细胞增殖的影响及其分子机制的探讨1)通过慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231细胞,建立稳定过表达SHP-1的细胞株;利用iRNA技术转染MCF-7-SHP1、MDA-MB-231-SHP1细胞,建立瞬时干扰SHP-1的细胞株,采用Western blot方法进行过表达和干扰效率的检测;2)MTT实验分别检测过表达和干扰SHP-1前后细胞增殖能力的变化;3)平板克隆实验检测过表达SHP-1前后细胞克隆形成能力的变化;4)EDU实验分别检测过表达和干扰SHP-1前后S期细胞比例的变化;5)流式细胞仪检测过表达SHP-1前后细胞周期分布的变化;6)Western blot检测过表达SHP-1前后细胞周期相关分子的变化,寻找SHP-1调控细胞周期的具体信号通路;7)裸鼠皮下成瘤实验检测过表达SHP-1前后细胞株体外成瘤能力的改变,并通过免疫组化实验检测上述通路中相关蛋白表达量的变化。3.SHP-1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制的探讨1)Transwell和Boyden实验分别检测过表达和干扰SHP-1前后细胞迁移、侵袭能力的变化;2)划痕实验检测过表达SHP-1前后细胞迁移能力的变化;3)Western blot检测稳定过表达SHP-1前后细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达量的变化,寻找 SHP-1调控细胞迁移和侵袭的具体信号通路;4)检测裸鼠瘤组织中EMT相关蛋白的表达情况。4.统计学分析:采用SPSS 16.0统计软件和GraphPad Prism进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。处理组和对照组间的比较采用两独立样本T检验;两组间率的比较采用四格表χ2检验,多组间率的比较采用R×C表χ2检验;生存曲线绘制用Kaplan-Meier方法,独立预后因素采用Cox风险比例回归模型进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.SHP-1在癌旁组织中的表达强度高于乳腺癌组织;统计分析表明,SHP-1的表达与ER、PR表达呈正相关,与肿瘤大小呈负相关,与TNM分期、HER2表达可能呈负相关关系;SHP-1高表达者的总生存期较SHP-1低表达者更长,SHP-1是乳腺癌患者生存的独立预后指标之一。1)SHP-1免疫组化染色,着色部位主要为细胞浆。在189例乳腺癌组织中,96例(占50.8%)高表达,93例(占49.2%)为低表达;在39例癌旁乳腺组织中,29例(占74.4%)高表达,10例(占25.6%)低表达;SHP-1在癌旁组织中的表达强度高于乳腺癌组织;2)统计分析表明,SHP-1的表达与ER、PR表达呈正相关,与肿瘤大小呈负相关;与TNM分期、HER2表达可能呈负相关关系;SHP-1的表达与下列临床病理特征未见明显相关性:患者年龄、组织学分级、淋巴结转移;3)SHP-1高表达者的总生存期较SHP-1低表达者更长(133.8月vs 111.2月),进一步对相关临床参数进行多因素分析发现,SHP-1是乳腺癌患者生存的独立预后指标之一。2.SHP-1抑制乳腺癌细胞的增殖及其分子机制的探讨1)慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231和脂质体转染MCF-7-SHP1、MDA-MB-231-SHP1细胞后,分别建立稳定过表达和瞬时干扰SHP-1的细胞株,Western blot检测表明分别上调和下调了 SHP-1的表达;2)MTT实验结果表明过表达SHP-1的细胞增殖能力减弱,干扰SHP-1的细胞增殖能力增强;EDU实验结果表明过表达SHP-1的细胞中S期细胞比例减少,而干扰SHP-1的细胞S期细胞比例增加;3)流式细胞仪周期检测表明过表达SHP-1的细胞处于G1期的比例增加,S+G2期比例降低;平板克隆实验结果表明过表达SHP-1的细胞克隆形成能力下降;4)Western blot检测结果表明SHP-1的表达增加后,细胞周期相关蛋白CyclinDl、c-Myc 的表达下调了,同时 H-ras、K-ras、p-Erkl/2、p-GSK3β、β-catenin的表达量也减少了,表明SHP-1 可能通过Ras/Erk/GSK3β/β-catenin信号通路来抑制乳腺癌细胞的增殖能力;5)裸鼠体外成瘤实验结果表明,SHP-1可以抑制肿瘤细胞体外成瘤能力,且过表达SHP-1后肿瘤组织中上述蛋白的表达量出现下调。3.SHP-1抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭及其分子机制的探讨1)Transwell和Boyden实验检测结果表明,过表达SHP-1的细胞迁移和侵袭能力减弱,而干扰SHP-1的细胞迁移和侵袭能力增强;2)划痕实验结果表明过表达SHP-1的细胞相对迁移率降低,SHP-1可以抑制乳腺癌细胞的迁移能力;3)Western blot实验结果表明,过表达SHP-1的细胞其EMT相关蛋白Snail、N-cadherin的表达降低,同时E-cadherin的表达升高;裸鼠肿瘤组织中N-cadherin、E-cadherin 的改变与 Western blot 结果一致。结合 h-ras、k-ras、p-Erkl/2、p-GSK3β 的表达下调,SHP-1 可能通过 Ras/Erk/GSK3β/Snail 信号通路来抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。结论1.SHP-1在癌旁组织中的表达强度高于乳腺癌组织;SHP-1的表达与ER、PR表达呈正相关,与肿瘤大小呈负相关,与TNM分期、HER2表达可能呈负相关关系,而与患者年龄、组织学分级、淋巴结转移无统计学差异;SHP-1高表达者具有更长的总生存期,SHP-1可以作为乳腺癌患者生存的独立预后指标之一。2.体外实验和动物实验证实SHP-1可以抑制乳腺癌细胞的增殖,具体通过Ras/Erk/GSK3β/β-catenin信号通路调控乳腺癌细胞的增殖。3.SHP-1蛋白可以抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,具体通过Ras/Erk/GSK3β/Snail信号通路来实现。