透明带（Zona pellucida,ZP）是围绕在哺乳动物卵母细胞外的一层相对较厚的细胞外膜。人和食蟹猴的透明带由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四种糖蛋白组成。透明带在卵母细胞的发育、成功受精以及胚胎着床前发育的过程中起着十分重要的作用。目前一些透明带的异常导致的不孕不育问题已不在少数。利用小鼠动物模型在一定程度上较清楚地研究了透明带的发生和功能,但是人和小鼠透明带在基因组成和结构组成等方面都有明显的差异性。通过ZP1蛋白序列的相似性比较发现,人的ZP1与猕猴属有94%的相似性,而与小鼠只有71%的相似性。本实验利用非人灵长类（食蟹猴）,检测不同卵泡中透明带蛋白的合成表达以及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研制ZP1突变的食蟹猴模型,将为深入探讨和理解灵长类透明带蛋白在透明带发生和受精过程中的作用奠定了基础,为研究由透明带异常导致的不孕提供动物模型。研究内容1:新鲜食蟹猴卵巢经过固定制作成7μm厚的石蜡切片,通过免疫组化染色分析ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四种蛋白在不同卵泡中的表达。结果表明,在原始卵泡时期,除ZP2蛋白没有表达外,其他三种糖蛋白均有表达;在初级卵泡期、次级卵泡期和窦卵泡期,四种糖蛋白均有表达。研究内容2:针对食蟹猴ZP1的ZP结构域片段设计4条sgRNA（分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4）。先体外检测其活性,再将体外转录制备的载体通过显微注射注入食蟹猴受精卵胞质中,观察胚胎发育,检测胚胎基因型。实验结果发现,在4条sgRNA的体外检测中,只有sgRNA3显示出有效的靶基因突变能力。在胚胎检测中,sgRNA3和sgRNA4都有突变活性,其中sgRNA3的突变效率达到了100%（12/12）,sgRNA4的突变效率达到了64.3%（9/14）。研究内容3:将潜在的ZP1突变的胚胎进行移植,获得新生猴,提取其组织DNA进行基因型鉴定,并分析其蛋白结构。实验结果显示,3只接受移植胚胎的受体母猴中,有1只怀孕并分娩得到2只仔猴,命名为花花和菜菜。经过脐带组织检测,发现花花和菜菜均为ZP1突变猴。其中花花的ZP1基因型有两种,突变型1（删减34个碱基）和突变型2（删减4个碱基）;菜菜的ZP1基因型有3种基因型,突变型3（删减9个碱基并插入3个碱基）、突变型4（删减49个碱基）和突变型5（删减54个碱基并插入2个碱基）。通过ZP1基因突变序列预测蛋白质结构,除突变型3外,ZP1突变型1、突变型2、突变型4和突变型5都遗失了ZP跨膜结构域。综上所述,食蟹猴的透明带糖蛋白在不同发育阶段卵泡中的表达存在差异。本论文成功研制了ZP1复合杂合突变的食蟹猴模型,这为研究透明带功能和异常导致的不孕奠定提供重要材料和思路。