前言乳腺导管内增生性病变是指乳腺导管上皮细胞具有一定异形性,但仍保存原有腺体结构或基底层,没有间质浸润的一类导管内增生性病变。根据组织细胞形态,分为普通导管内增生(Usual ductal hyperplasia,UDH)、导管上皮内肿瘤(Ductalintraepithelial neoplasia,DIN)1A级、1B级、1C级、2级、3级。长期以来一直认为,正常上皮经过增生、不典型增生、原位癌等进展为浸润性癌是一个连续过程,但是乳腺导管内增生性病变究竟在哪个阶段演变为肿瘤,目前还是悬而未决的问题。肿瘤起源于单个细胞,即单克隆性增生,而以修复为目的的反应性增生则为多克隆,所以克隆性分析是区别肿瘤性增生和反应性增生的关键。基于女性X染色体嵌合性失活的雄激素受体基因多态性分析是最常用和最理想的一种克隆性分析方法。按照一般理论,恶性肿瘤发生发展的多步骤过程是基因损伤逐渐积累的结果。在这个竞争性选择过程中,获得新的基因改变被认为是肿瘤进展的限速步骤。PI3K/AKT信号通路调控细胞的生存、增生和迁移等生物学行为,和人类肿瘤密切相关,如PTEN通过基因缺失或突变等造成的功能缺失以及AKT和PIK3CA等基因扩增都参与肿瘤的发生。不过最令人振奋的是最近发现IA类PI3Ks的p110α的编码基因PIK3CA在结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤高频率突变,90%以上的突变位点集中在螺旋区和激酶区,突变的p110α活性增加。PIK3CA在乳腺癌组织中的扩增率只有8.7%,而突变率达20%以上,被认为是除p53突变和HER2扩增之外最常见和最重要的乳腺癌基因改变。PIK3CA基因突变发生在乳腺癌演进过程中的哪个阶段?该基因突变后对乳腺癌的演进进程有何影响?关于这些问题都没有相关的文献报道。ER,PR,HER2和淋巴结转移状态等病理学指标与乳腺癌治疗方案的选择以及预后有关,但是关于这些病理学指标与PIK3CA基因突变相关性的文献报道还比较少,并且观点不一致。基于上述研究背景,本课题运用X染色体连锁雄激素受体基因多态性分析的方法,分析女性乳腺导管内增生性病变的克隆性以提供其肿瘤性增生的直接证据;检测乳腺导管内增生性病变和浸润性癌组织中PIK3CA基因突变,明确PIK3CA突变在乳腺癌发生发展过程中发生的时间,以便于更有针对性地进行相关功能研究;阐述PIK3CA突变与乳腺癌临床病理特征的关系,为将来预后评估和个性化的治疗提供依据。第一部分乳腺导管内增生性病变的克隆性分析目的检测各类乳腺导管内增生性病变的克隆性起源,明确哪类乳腺导管内增生性病变为真正的肿瘤。方法以101例女性乳腺导管内增生性病变石蜡组织标本为研究对象。激光捕获显微切割技术分别将增生的和周围正常的导管上皮细胞精确分离,抽提其基因组DNA。设计X染色体人雄激素受体(human androgen receptor,HUMARA)基因外显子1的PCR扩增引物并标记荧光,所跨区域包含与X染色体失活有关的甲基化位点和呈高度多态性的CAG三核苷酸短串联重复序列(short tandem repeat,STR)。甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ消化前、后的基因组DNA为模板,PCR扩增HUMARA外显子1,然后在DNA测序仪上毛细管电泳并分析HUMARA两个位点的荧光强度。结果101个病例中,有88例PCR扩增HUMARA外显子1成功。其中20/88(22.73%)的病变周围正常组织DNA在未经HpaⅡ消化时,扩增出一条条带,即(CAG)n呈纯合性,排除出此实验。其余68例作为研究对象,其中9/12 UDH和5/18 DIN1A的DNA在HpaⅡ消化前后均扩增出两条荧光强度相近的条带(0.33＜CR＜3.00),即它们的X染色体失活是随机的,呈多克隆性。3/12 UDH,13/18DIN1A,28/28 DIN1B,10/10原位癌在HpaⅡ消化后扩增出一条带或两条强度差别较大的条带(CR＜0.33,或＞3.00),而相应的周围正常乳腺组织在HpaⅡ消化前后均扩增出两条强度相近的条带(0.33＜CR＜3.00),提示它们为单克隆起源。原位癌和DIN 1B比DIN 1A具有更高的单克隆率(P=0.006,Fish exact test),DIN1A的单克隆率比UDH的高(P=0.003,Fish exact test)。结论大部分DIN1A、DIN1B和原位癌为单克隆起源,呈肿瘤性增生。第二部分检测乳腺导管内增生性病变和浸润性癌组织的PIK3CA基因突变目的检测乳腺导管内增生性病变和浸润性乳腺癌组织中PIK3CA基因突变,明确PIK3CA在乳腺癌发生发展过程中突变的时间方法选取各级乳腺导管内增生性病变石蜡组织标本共127例和114例浸润性乳腺癌新鲜组织标本作为研究对象。激光捕获显微切割技术将病变细胞和周围正常上皮细胞精确分离,抽提其基因组DNA。PCR扩增PIK3CA外显子9和20,PCR产物纯化后直接测序。结果总共检测到了50个体细胞错义突变,其中17个位于编码螺旋区的外显子9,33个位于编码激酶区的外显子20。H1047R(A3 140G)30例,G1049R(G3145C)2例,G3292T1例,E542K(G1624A)7例,E545K(G1633A)9例,1543T(T1628C)1例。其中G3292T和1543T(T1628C)是本研究新发现的突变。PIK3CA在乳腺导管内增生性病变组织中的突变率为18/127(14.17%),分别是DINlA 1例,DIN1B 2例,DIN1C以上级别即原位癌15例,16例UDH未检测到突变。114例浸润性乳腺癌中共检测到32例突变。可见,DIN1B以下级别组的该基因的突变率(4.41%,P=-0.001,x~2检验)明显低于DIN1C以上级别(25.42%,P=-0.001,x~2检验)和浸润性癌组(28.07%,P=0.000,x~2检验),DIN1C以上级别组和浸润性乳腺癌组的PIK3CA突变率没有差异(P=0.711,x~2检验)。结论PIK3CA基因从乳腺原位癌阶段开始突变,是乳腺癌发生发展过程中的晚期事件。第三部分PIK3CA基因突变与乳腺癌临床病理学特征的相关性目的探讨PIK3CA基因突变与乳腺癌临床病理学特征的相关性方法59例乳腺原位癌和114例浸润性乳腺癌作为研究对象,收集病人年龄,肿瘤大小,淋巴结转移情况等病理学资料;免疫组化EnVision二步法显示乳腺癌组织内ER,PR,HER2,PTEN,Ki67和p53蛋白水平。结果ER阳性乳腺癌PIK3CA突变率高于阴性者(31.21%vs 9.38%,P=0.012,x~2检验)。PR阳性乳腺癌PIK3CA突变率高于阴性者(35.58%vs 14.49%,P=0.002,x~2检验)。PIK3CA基因突变和PTEN蛋白缺失呈负相关(P=0.006,x~2检验)。114例浸润性癌肿块最大径0.5-5cm(中位数2cm),PIK3CA突变型肿瘤肿块的最大径0.6-3cm(中位数1.75cm),野生型肿瘤肿块的最大径0.15-5cm(中位数2cm),PIK3CA基因突变型和野生型之间肿瘤大小没有差异(P=0.486,两样本的等级和检验);淋巴结转移组和未转移组之间的PIK3CA基因突变率没有差异(26.19%vs29.17%,P=0.733,x~2检验);PIK3CA突变率与肿瘤分级和分期没有相关性:1级肿瘤13/62(20.97%)PIK3CA基因突变,2级13/41(31.71%),3级6/11(54.55%)(P=0.097);Ⅰ期乳腺癌16/45(35.55%)PIK3CA基因突变,ⅡA期7/42(16.67%),ⅡB期9/27(33.33%)(P=0.115,x~2检验)。HER2正常表达和过表达病人PIK3CA基因的突变率没有差异(28.78%vs 20.59%,P=0.336,x~2检验),PIK3CA基因突变与免疫组织化学检测到的p53蛋白水平没有相关性(P=0.320,x~2检验)。PIK3CA野生型肿瘤和突变型之间的Ki67增生指数没有差异(17.30%±k13.62%vs12.30%±13.22%,P=0.866,两样本的等级和检验)。结论PIK3CA基因突变与免疫组织化学检测到的ER,PR蛋白水平呈正相关;PIK3CA基因突变与PTEN蛋白缺失呈负相关;PIK3CA基因突变与乳腺癌的分级、分期、肿瘤大小、淋巴结转移以及免疫组织化学检测到的p53和HER2蛋白水平以及Ki67增生指数没有相关性。