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目的：本研究的目的是建立具有高感染性、高病毒产量的稳定的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的体外细胞株,建立完善的病毒检测、定量技术。为我们更好的认识HCV生活周期、宿主与病毒间的相互作用奠定实验室基础,有助于抗病毒药物和疫苗的开发。
方法：提取Huh7细胞总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增CD81,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD81,并测序鉴定。用脂质体转染方法将重组质粒转染至Huh7细胞中,经G418200mg/ml筛选一个月后,获得高表达CD81的Huh7细胞系(CD81-Huh7),RT-PCR及流式细胞术法测定其CD81表达水平。将HCV质粒(JFH-1,2a)及其阴性对照质粒(JFH-1/GND)体外转录成RNA后,分别电转至Huh7细胞和CD81-Huh7细胞中,RT-巢氏PCR法及实时定量PCR法(Realtime PCR)检测细胞和培养上清液中HCV RNA水平,并进行比较。利用间接免疫荧光法检测细胞中HCV核心蛋白的表达情况。收集CD81-Huh7细胞电转后第8天细胞上清液并重新感染Huh7和CD81-Huh7细胞,Realtime PCR法检测细胞中病毒RNA的表达,电镜负染观察细胞培养上清液中HCV颗粒。
结果：
1.用限制性内切酶酶切及PCR法检测质粒pcDNA3.1-CD81,结果显示质粒pcDNA3.1-CD81构建成功。经DNA测序分析,与Genbank中CD81序列完全一致,证实获得正确的pcDNA3.1-CD81质粒。
2.经G418筛选后获得一株高表达CD81的Huh7细胞系(CD81-Huh7),RT-PCR及流式细胞术检测结果证实CD81-Huh7细胞中CD81基因和蛋白表达水平均明显高于Huh7细胞组。
3.将JFH-12a RNA电转至Huh7及CD81-Huh7细胞后,经RT-巢式PCR法和Realtime PCR法检测发现CD81-Huh7细胞和上清液中病毒RNA的水平均明显高于Huh7细胞组1-2 log。
4.对HCV核心蛋白进行间接免疫荧光染色结果显示,将JFH-1 RNA转染到Huh7和CD81-Huh7细胞后,在两种细胞胞浆中均可见到绿色荧光HCV核心蛋白的表达。相同细胞数目情况下,视野下有绿色荧光核心蛋白的CD81-Huh7细胞数目明显多于Huh7细胞,而且在CD81-Huh7细胞胞浆内绿色荧光的强度明显高于Huh7细胞。提示CD81-Huh7细胞内HCV病毒RNA的含量高于Huh7细胞,CD81-Huh7细胞明显提高了HCV的再感染效率。
5.收集CD81-Huh7细胞电转后第8天的上清液,加入未感染的CD81-Huh7和Huh7细胞,CD81-Huh7被感染的效率仍然高于Huh7细胞。电镜下负染可以见到HCV病毒颗粒。
结论：
1.成功构建了pcDNA3.1-CD81重组质粒。
2.本课题在HCV JFH-1模型的基础上进行了优化,将CD81分子导入Huh7细胞,建立了高表达CD81的Huh7细胞系(CD81-Huh7),该细胞系可明显提高体外HCV病毒颗粒的产生,且产生的病毒颗粒具有一定的感染性。为抗病毒药物和疫苗的筛选及HCV致病机制的深入研究奠定了基础。