用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的研究

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  目的:蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞增殖和分化、信号的转导和加工等方面起重要作用。CK2在睾丸及脑组织中活性最高,睾丸组织中CK2α’亚基水平是脑组织的两倍,CK2β亚基比脑组织高3-4倍,比其它组织高将近8-10倍。敲除了小鼠CK2α亚基的基因Csnk2a2的纯合子鼠,其生殖细胞严重减少并产生圆头精子而导致不育,与人类圆头精子综合症相似。Csnk2a2即CK2α’可能是这种遗传综合症的候选基因。为研究CK2α’亚基在精子发生中的作用机制,本研究拟利用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选与蛋白激酶CK2α’亚基相互作用的蛋白。 方法:将构建于pACT2质粒(酵母双杂交中的AD质粒)的人睾丸cDNA文库和本室已成功构建的BD质粒共转染感受态酵母菌AH109。用AD质粒和BD质粒进行酵母双杂交实验,以初步筛选出阳性候选克隆,再对上述筛选的阳性候选克隆进行一对一回复性杂交,最后筛选出真阳性克隆(即与人蛋白激酶CK2α相互作用的蛋白)。经上述一对一回复确证为阳性相互作用的AD质粒,以pACT2质粒的通用引物为测序引物测定该质粒的插入片段cDNA序列。通过国际互联网络,以美国国立生物信息中心(NCBI)的BLAST作为主要的检索工具,检索主要程序采用BLASTN,对相互作用蛋白的cDNA序列进行同源性分析,最终确定该相互作用蛋白的名称。并用GST-pulldown在细胞外进一步证实蛋白质问的相互作用。 结论:用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选出8种与人蛋白激酶CK2α相互作用的蛋白。人蛋白激酶CK2α’与人转换蛋白1(TP1)在细胞内及细胞外均有相互作用。 
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