【摘 要】
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目的:探讨TYROBP基因与认知障碍及铁死亡的关系,我们首先通过水迷宫实验验证TYROBP基因敲除小鼠是否具有认知障碍,然后再通过检测与铁死亡通路相关的蛋白表达、m RNA的转录情况,分析TYROBP基因是否通过介导铁死亡来参与认知障碍的发生,以及TYROBP基因在该过程中是否有着保护作用。方法:我们对构建的2月龄杂合型TYROBP基因敲小鼠(TYROBP-/+)进行纯化、繁殖,通过基因测序技术筛
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目的:探讨TYROBP基因与认知障碍及铁死亡的关系,我们首先通过水迷宫实验验证TYROBP基因敲除小鼠是否具有认知障碍,然后再通过检测与铁死亡通路相关的蛋白表达、m RNA的转录情况,分析TYROBP基因是否通过介导铁死亡来参与认知障碍的发生,以及TYROBP基因在该过程中是否有着保护作用。方法:我们对构建的2月龄杂合型TYROBP基因敲小鼠(TYROBP-/+)进行纯化、繁殖,通过基因测序技术筛选出TYROBP基因敲除杂合型(TYROBP-/+)、TYROBP基因敲除纯合型(TYROBP-/-)、野生型（WT）小鼠。本实验以不同月龄（2月龄、6月龄、12月龄）的WT和TYROBP-/-小鼠为研究对象,通过水迷宫实验来检测不同月龄、不同基因型小鼠的认知行为学变化,通过ANY-maze系统跟踪记录水面上各组实验小鼠的运动路径;通过Western blot实验来检测不同基因型、不同月龄小鼠脑组织（海马）中铁死亡通路蛋白（GPX4、SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1）的表达水平;应用QPCR技术检测各组小鼠铁死亡相关因子（GPX4、SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1）转录水平的表达情况。本实验所用的数据均使用SPSS22.0软件来进行归纳分析,用（?）±s表示相关计量资料数据,对于本实验涉及的多个样本均数进行比较时,要先进行F检验,方差齐时使用双因素方差分析（two-way ANOVA）,方差不齐时使用Kruskal-Wallis H检验进行统计分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.本研究成功的构建了不同月龄的WT小鼠、TYROBP-/-小鼠。2.通过对2月龄、6月龄、12月龄的WT和TYROBP-/-小鼠进行水迷宫实验发现:（1）在定位航行训练实验中,各组实验小鼠所记录到的逃避潜伏期,与训练天数成反比（训练天数越长,潜伏期越短）;2月龄与6月龄的TYROBP-/-小鼠与同月龄WT小鼠相比,其6天的逃避潜伏期无显著性差异（P>0.05）;在定位航行实验的第4、5、6天,12月龄TYROBP-/-小鼠的逃避潜伏期明显长于同月龄WT小鼠,且差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）12月龄的TYROBP-/-小鼠主要以“随机式”的搜索策略寻找平台,而其他月龄不同基因型小鼠在开始试验阶段以“边缘式”或“随机式”为主,后转向“趋向式”为主。（3）在空间探索实验中,与12月龄的WT小鼠相比,同月龄TYROBP-/-小鼠的穿越平台次数明显较少（P<0.05）;而2月龄、6月龄两种不同基因型小鼠的穿越平台次数均无明显改变（P>0.05）;同时12月龄TYROBP-/-小鼠与同龄WT小鼠相比,其在目标象限游泳时间百分比明显呈下降趋势（P<0.05）,而2月龄、6月龄两种不同基因型小鼠之间无明显差异（P>0.05）。3.铁死亡通路各蛋白表达水平:在2月龄、6月龄的WT小鼠、TYROBP-/-小鼠中,铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1在同龄小鼠中的表达无明显差异（P>0.05）,与同月龄WT小鼠相比,12月龄TYROBP-/-小鼠铁死亡相关蛋白SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1的表达明显升高,而GPX4的表达量明显降低（P<0.05）。4.12月龄TYROBP-/-小鼠的铁死亡相关基因:SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1转录水平均高于同龄WT小鼠,GPX4转录水平低于同龄WT小鼠。结论:1.12月龄的TYROBP-/-小鼠空间认知与学习记忆能力较同龄WT小鼠明显下降,存在明显的认知障碍。2.12月龄TYROBP-/-小鼠的铁死亡相关蛋白SLC7A11、ACSL4、ALOX15、ALOX15B、PEBP1表达量较同龄WT小鼠明显增多,GPX4表达量低于同龄WT小鼠,说明TYROBP基因介导铁死亡的发生,TYROBP基因敲除可以导致认知障碍。3.通过QPCR实验,从转录水平再次验证了,12月龄的TYROBP-/-小鼠铁死亡表达增加,TYROBP基因敲除促进铁死亡的发生,进一步导致认知障碍的发生。综上所述:TYROBP基因可以通过介导铁死亡参与认知障碍。本研究通过研究TYROBP基因、铁死亡与认知障碍的关系,更好的理解认知障碍的发病机制以及影响认知障碍的遗传因素,为以AD为代表的认知障碍疾病的诊断和治疗,提供了新的思路。
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