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施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501是从我国南方水稻根际土壤分离的一株联合固氮菌,在微好氧条件下能将空气中氮气固定为植物可以吸收利用的铵。但随着环境中的氮素含量变化和碳源供应不足,其联合固氮效率受到很大限制。NtrC蛋白是细菌氮代谢调控的全局性调控因子,具有维持生物体细胞碳氮平衡的重要作用。本研究以A1501的ntrC基因为研究对象,构建了ntrC基因突变株,对NtrC生物学功能进行鉴定,同时利用实时荧光定量PCR分析NtrC可能调控的靶基因的表达,从而初步探讨NtrC参与固氮调控的分子机制。主要研究结果如下: 1、本文利用同源重组的方法,构建含氯霉素抗性盒的重组质粒,采用三亲结合的方法将重组质粒导入野生型施氏假单胞菌A1501中,经同源重组双交换筛选到ntrC的缺失突变株,命名为ΔntrC。在LB及A15限制性培养基上,ΔntrC均能正常生长。在以硝酸钾和尿素为唯一氮源的培养基中生存能力下降,表明NtrC直接或间接参与硝酸盐和尿素吸收代谢途径的调控。 2、与野生型相比,ΔntrC固氮酶活性下降了90％。实时荧光定量PCR结果显示固氮条件下△ntrC中固氮酶调节基因nifLA和结构基因nifHDK的表达量下调了5倍多。为进一步确定ΔntrC基因的生物学功能,本研究在ΔntrC中导入cbrB基因,获得cbrB过量表达株ΔntrC(cbrB),发现ΔntrC(cbrB)能使ΔntrC的部分固氮酶活性得到恢复。以上结果表明,NtrC对固氮酶基因的表达起到重要的作用,同时NtrC与碳代谢调控蛋白CbrB存在功能上的重叠。 3、ΔntrC的趋化和反硝化能力有所下降,表明NtrC直接或间接参与趋化和反硝化途径中相关基因的表达调控。ΔntrC氧胁迫耐受能力增强,实时荧光定量PCR结果显示过氧化氢酶基因katE、过氧化物歧化酶基因sodC显著上调。以上结果说明A1501中NtrC除了调控氮代谢外,还在其他代谢途径中有重要作用。 4、在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了携带质粒pET28a的NtrC-His融合蛋白,纯化并制做了抗体;通过生物信息学方法预测了A1501中NtrC调控基因的保守序列,可用于下一步的NtrC与靶基因启动子的分子互作研究。 本研究揭示了施氏假单胞菌A1501中NtrC的功能多样性。为进一步开展NtrC对靶标分子识别规律和全基因组水平上的NtrC全局调控机制研究提供了重要的理论依据。