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核酸等温扩增技术(Isothermal amplification technology)的反应过程始终维持在恒定温度,不需要精密的温度控制仪器,在体外核酸检测方面有独特的优势,是一种便利的体外核酸快速检测方法。而环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在60-65℃条件下,通常在一小时内进行核酸扩增,是一种强大的等温核酸扩增方法,反应产生大量焦磷酸镁白色沉淀,所以可以通过肉眼观察来判断靶基因是否存在。但缺点是在反应过程中常发生非特异性扩增而产生假阳性信号。为了提高检测结果的准确性,本论文分别将LAMP扩增与一步链置换反应(One-step strand displacement,OSD)和杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)联用,并分别借流式细胞仪、血糖仪等最终实现了诺如病毒基因的多手段灵敏检测。在磁球协助的分离纯化后,实现了在外加粪便中检测到了30个拷贝的诺如病毒DNA。具体研究内容如下:LAMP与OSD联用,借助实时荧光定量PCR仪检测诺如病毒:普通的DNA染料(Evagreen)没有特异性识别DNA序列的功能,而OSD探针可对LAMP产物进行特异性识别。因而,通过LAMP-OSD的偶联,通过优化反应条件,可以避免假阳性问题。但是,在粪便溶液中检测诺如病毒或者加入具有干扰性的轮状病毒LAMP产物时,LAMP-OSD荧光信号易受影响,而不利于信号的检测。LAMP与HCR联用,借助流式细胞仪检测诺如病毒:本研究提出了LAMP与HCR联用型基因检测新技术,并对该联用技术的可行性、必要性和技术优势进行了验证。带有荧光基团的DNA在磁球表面发生LAMP-HCR扩增。将带有LAMP-HCR产物的磁球应用流式细胞仪进行检测,最低可检测到30拷贝的诺如病毒基因。由于磁球的分离纯化作用,即使加入不同百分比的粪便样品(0.1%~2%),检测效果完全没有受到影响。LAMP与HCR联用,借助血糖仪检测诺如病毒:带有蔗糖酶的DNA在上述的磁球表面发生LAMP-HCR扩增,然后将带有扩增产物的磁球与蔗糖混合,蔗糖酶会水解蔗糖为葡萄糖,进而可用血糖仪进行检测。在2%的粪便样品中,也可检测到30拷贝的诺如病毒基因,同时还可实现诺如病毒的现场快速诊断。