研究背景骨质疏松症是我国中老年群体高发的常见疾病之一。在疾病早期,患者通常没有显著的临床表现,主要体现为低骨量和骨密度。随着病情的进展患者可出现疼痛、脊柱变形和骨折,生活质量受到严重影响。在正常的骨微环境中,破骨细胞、成骨细胞分别负责骨吸收和骨生成,二者的活动始终处于一种不断更新的相对平衡状态。目前认为,骨质疏松症的发病机制与破骨细胞骨吸收增强、成骨细胞骨生成不足导致的骨重塑失衡有关。双特异性磷酸酶6（DUSP6）是一种丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶,负责在单个蛋白底物中的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基上去磷酸化,与细胞增殖和分化等生物功能紧密相关。研究表明,DUSP6可介导炎症相关的T细胞激活和分化。BCI,也叫做（E）-BCI,是一种DUSP6的小分子抑制剂,分子量约为317,据报道可以抑制DUSP6表达并促进斑马鱼胚胎中成纤维细胞生长因子的表达。另一项研究发现,BCI可经由Nrf2信号减弱脂多糖（LPS）介导的巨噬细胞炎症。当前BCI相关的研究主要集中在肿瘤、免疫和炎症反应方向,关于其在骨代谢包括破骨细胞的形成和分化中发挥的作用尚不清楚。本研究主要是探讨DUSP6抑制剂BCI对破骨细胞激活与分化的影响及相关的调节机制,为靶向骨质疏松性骨丢失的临床治疗提供一种新的策略。研究方法在第一部分,我们通过CCK-8实验探究了BCI对小鼠巨噬细胞系RAW264.7及小鼠原代骨髓巨噬细胞（BMMs）的细胞毒性作用,检测了BCI对BMMs细胞凋亡和周期的影响,并检测最适浓度下的BCI对破骨细胞前体DUSP6表达的抑制作用。在第二部分,我们通过TRAP染色、q RT-PCR、Western blot、FAK染色、细胞免疫荧光、骨片吸收实验系统全面地评估了特定浓度下的BCI对RANKL介导的破骨细胞形成、融合及骨吸收活性的影响。在第三部分,为了探究BCI抑制破骨细胞分化的潜在分子机制,我们通过转录组测序（RNA-seq）、生物信息学分析进行初步探究,并采用Western blot、Co-IP验证分析结果。在第四部分,我们通过建立双侧卵巢切除（OVX）骨质疏松小鼠模型来评估BCI对骨质疏松症性骨丢失的缓解和保护作用。研究结果1.低剂量（≤2μM和≤4μM）的BCI对RAW264.7和BMMs没有明显的细胞毒性。流式细胞术结果表明,BCI（≤4μM）对BMMs的细胞周期和凋亡无明显影响。在RANKL介导的破骨细胞激活过程中,BCI抑制了RAW264.7细胞和BMMs中的DUSP6蛋白表达。这些结果表明,BCI能有效抑制DUSP6蛋白的表达而不影响细胞周期和细胞凋亡。2.TRAP染色、q RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光结果表明,特定浓度下的BCI可显著抑制RANKL介导的破骨细胞形成与分化;FAK与q RT-PCR结果表明,特定浓度下的BCI可显著减弱RANKL介导的破骨细胞融合;骨片吸收实验表明,BCI显著降低RANKL介导的破骨细胞骨吸收活性。3.RNA-seq测定了有无BCI干预的RANKL诱导的RAW264.7细胞转录组表达情况。测序结果发现,在BCI干预组中有177个基因表达量下调和45个基因表达量上调。BCI干预组中破骨细胞分化关键基因表达显著降低,这与上一章节中的q RT-PCR结果一致。GO和KEGG富集分析预测了BCI处理后前50个最显著的差异表达基因（DEGs）代表的主要功能。这些基因的生物学过程主要富集在受体配体活性、趋化因子活性和破骨细胞分化调控;分子功能涉及对脂多糖的应答、中性粒细胞迁移和趋化。KEGG通路富集结果显示了几个可能的信号通路,包括细胞因子及其受体相互作用、破骨细胞分化、类风湿关节炎、NF-κB和TNF信号相关的通路。以上结果不仅再次确认了BCI抑制破骨细胞生成,并且提示了可能的下游分子信号通路。GSEA结果显示,通过NF-κB的TNF-α信号在RANKL诱导组中显著富集,而在BCI处理组较少富集。此外,NF-κB/p65核转位的免疫荧光染色实验结果显示,RANKL诱导组中发生了明显的NF-κB/p65核转位,而在BCI处理组中这一过程被显著抑制。此外,Co-IP实验发现NF-κB/p65和NFATc1之间的蛋白结合受到BCI的显著抑制。Western Blot结果表明,BCI可通过减弱STAT3和NF-κB信号抑制RANKL介导的破骨细胞分化。4.采用micro-CT评价骨质疏松模型小鼠股骨小梁区的骨丢失情况,我们观察到,在低浓度和高浓度BCI处理组中,骨质疏松小鼠骨小梁区域的骨丢失状况得到了不同程度的缓解。定量分析显示,与OVX组相比,BCI干预组动物的骨体积/总组织体积（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）、骨密度（BMD）和骨表面密度（BS/TV）明显增加。与micro-CT结果一致,H＆E和Masson染色显示OVX组的样本在股骨远端骨小梁区域有明显的骨破坏,然而BCI处理组样本中很少观察到这种情况。此外,在TRAP染色结果中,相对于Sham组,OVX组小鼠样本的骨小梁区域附近检测出大量的TRAP+细胞。相比于OVX组,高浓度与低浓度BCI处理组小鼠骨小梁区域的TRAP+破骨细胞数量明显减少。我们接着分离实验动物的肝脏和肾脏并采取组织学分析。H＆E染色结果显示,BCI干预组小鼠肝、肾结构未显示明显的病理改变。这些结果表明,BCI在没有明显肝肾毒性的情况下可通过抑制破骨细胞的激活缓解OVX骨质疏松小鼠的骨质丢失。研究结论本文首次探究了BCI对RANKL介导的破骨细胞生成的效果及相应机制。体外实验结果表明BCI可显著抑制RANKL介导的破骨细胞激活与分化、融合和骨吸收能力,并且这种抑制效应可能是通过阻断STAT3与NF-κB信号并抑制NF-κB/p65与NFATc1的结合实现的。此外,体内实验结果表明BCI有效减轻OVX诱导的骨质疏松小鼠的骨丢失。我们的结论为骨质疏松药物的研发提出了一种新的思路,也为靶向骨质疏松症性骨质丢失的治疗提供了不同的策略。