研究背景:肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）是一种以肺血管明显重塑、肺循环负荷进行性升高,导致右心室肥厚和重塑为特征的综合征。其血流动力学诊断标准为:在海平面静息状态下,右心导管检测肺动脉平均压力≥25mm Hg。2019年,WHO的报告指出,全球约有1%的人口患有PAH,约有50%的心衰患者受其影响,尽管针对PAH的药物和治疗策略在近年来已经得到了长足发展,但是其5年死亡率依旧低于30%[1]。肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）的增殖是导致PAH的关键环节,在健康人中,收缩态的PASMCs通常表现出非常低的合成和增殖活性,并表达一组独特的收缩蛋白和信号分子。而为了应对低氧、血管损伤、炎症等刺激,PASMCs经过表型转化,转化为去分化表型,具有高增殖、高迁移能力并伴有凋亡抵抗[2]。有大量研究表明,表观遗传修饰参与了PAH的病理过程,作为一种RNA甲基化修饰,N6,2’-O-二甲基腺嘌呤（N6,2’-O-dimethyladenosine,m6Am）修饰存在于92%的真核生物的m RNA 5′端7-甲基鸟苷帽（m7Gppp N）结构中,和N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰类似,也是通过甲基化转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）以及识别因子（readers）共同参与生物过程[3,4]。而磷酸化CTD相互作用因子1（Phosphorylated CTD Interacting Factor 1,PCIF1）作为唯一已知的m6Am甲基化转移酶,其在PAH这一疾病过程中的表观遗传修饰作用仍有待探究[5]。低氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是机体直接感受氧气浓度变化的基因,是促进PASMCs增殖和血管重塑的关键因子,在PAH中发挥了关键作用。在常氧状态下,脯氨酸羟化酶2（Prolyl hydroxylase domain 2,PHD2）使HIF-1α的脯氨酸残基羟化,使其被肿瘤抑制蛋白（von Hippel-Lindau protein,VHL）识别,最终通过泛素化介导的蛋白酶体途径降解。PHD2的表达是抑制HIF-1α介导的PASMCs增殖的关键因素[6,7]。因此,我们推测PCIF1可能通过其m6Am甲基化转移酶的功能,改变了PHD2的m6Am修饰水平,从而使PHD2的m RNA稳定性增加、表达增加,从而抑制HIF-1α通路,抑制PASMCs的增殖从而改善PAH。研究方法:第一部分:1.为了探索PCIF1在PAH中的作用,我们首先构造两种PAH动物模型,分别为:低氧诱导的小鼠PAH模型和MCT诱导的大鼠PAH模型,然后通过Western blot和免疫荧光的方法检测PCIF1的表达变化。2.在体内实验中,我们通过尾静脉注射腺相关病毒2型（Adeno-Associated Virus Epitope 2,AAV2）来敲降或过表达PCIF1,然后再利用Western blot的方式检测AAV2的敲降和过表达效率。3.低氧暴露4周诱导PAH,通过观察AAV2-null对照组以及AAV2-sh-PCIF1敲降组中右心室收缩压、富尔顿指数、肌化指数和平均动脉中层厚度等指标来评价敲降PCIF1对PAH的影响。4.低氧暴露4周诱导PAH,通过观察AAV2-null对照组以及AAV2-oe-PCIF1过表达组中右心室收缩压、富尔顿指数、肌化指数和平均动脉中层厚度等指标来评价过表达PCIF1对PAH的影响。第二部分:1.通过免疫荧光的方法鉴定原代PASMCs细胞;再利用腺病毒瞬时感染PASMCs,通过Western blot检测敲降和过表达PCIF1的效率。2.上述研究发现,在PAH组中,PCIF1在增殖的血管平滑肌层中的表达显著降低,因此,为了探究PCIF1是否可以调节PASMCs的增殖能力从而调节血管重塑,影响PAH的进展。我们通过CCK-8增殖实验、Ed U掺入实验来检测敲降和过表达PCIF1对PASMCs增殖能力的影响。3.上述研究发现,过表达PCIF1抑制PASMCs增殖,且PCIF1是m6Am甲基化转移酶。因此,为了探究PCIF1是否通过其m6Am甲基化转移酶的作用来调节PASMCs增殖,我们首先构建PCIF1甲基化转移酶位点突变的腺病毒,然后再通过CCK-8增殖实验和Ed U掺入实验,来检测在PCIF1甲基化转移酶位点突变之后,其抑制PASMCs增殖的作用是否消失。第三部分:1.因为HIF-1α对氧气浓度的变化异常敏感,是PAH的关键环节,我们将空病毒对照（Ad-null）和PCIF1野生型过表达组（Ad-oe-PCIF1）暴露在低氧状态下,来检测PCIF1对HIF-1αm RNA和蛋白表达的影响。并加入CHX和MG132,检测PCIF1对HIF-1α蛋白泛素化降解的影响。2.为了探索PCIF1是否通过m6Am修饰途径调控HIF-1α的蛋白表达,我们将PCIF1的甲基化转移酶位点突变,再次检测突变的PCIF1对HIF-1αm RNA和蛋白水平的调控。3.通过之前的实验我们发现,过表达PCIF1促进了HIF-1α蛋白的降解,而PHD2介导的泛素化-蛋白酶体途径是HIF-1α降解的主要方式。因此我们通过qRT-PCR实验,检测PHD2的m RNA的变化,并通过加入Act D来检测PCIF1对PHD2 m RNA的半衰期的影响。研究结果:第一部分:1.相较于对照组,PCIF1在PAH组中的表达显著下降,在增殖的肺动脉平滑肌层中尤其明显。2.通过Western blot实验,我们发现与AAV2-null空病毒对照组相比,AAV2-oe-PCIF1过表达组的肺动脉中PCIF1的表达显著增加,AAV2-sh-PCIF1敲降组中的PCIF1的表达显著下降,证明腺相关病毒感染成功。3.低氧暴露4周之后,相对于AAV2-null对照组,AAV2-sh-Pcfi1敲降组小鼠的右心室收缩压、富尔顿指数、平均动脉直径和肌化指数显著增高,说明敲降PCIF1可以加剧PAH的发展。4.低氧暴露4周之后,相对于AAV2-null对照组,AAV2-oe-Pcfi1过表达组小鼠的右心室收缩压、富尔顿指数、平均动脉直径和肌化指数显著降低,说明过表达PCIF1可以缓解PAH的进展。第二部分:1.通过免疫荧光发现,提取的原代细胞α-SMA高表达,证明是原代PASMCs。通过Western blot发现,与Ad-null空病毒对照组相比,Ad-oe-PCIF1过表达组中PCIF1表达上升,Ad-sh-PCIF1敲降组中PCIF1表达下降,证明腺病毒感染成功。2.通过CCK-8增殖实验、EdU掺入实验证实,在低氧条件下暴露24h可以使PASMCs的增殖能力显著增加;同时,过表达PCIF1显著减少了PASMCs在低氧条件下的增殖能力,而敲降PCIF1则增加了PASMCs的增殖能力。3.通过CCK-8增殖实验、Ed U掺入实验证实,在低氧条件下暴露24h后,相对于Ad-null空病毒对照组,Ad-oe-PCIF1过表达组抑制了PASMCs的增殖,而过表达Ad-mut-PCIF1甲基化转移酶位点突变组则无法抑制PASMCs的增殖,说明PCIF1的m6Am甲基化转移酶的功能是其抑制PASMCs增殖的原因。第三部分:1.通过qRT-PCR和Western blot实验,我们发现过表达PCIF1降低了低氧暴露下PASMCs中的HIF-1α蛋白的表达而不改变其m RNA的表达,加入CHX和MG132后,证明PCIF1通过促进HIF-1α蛋白泛素化降解,从而下调HIF-1α的蛋白表达。2.通过qRT-PCR和Western blot实验,我们发现过表达甲基化转移酶位点突变后的PCIF1,不能改变HIF-1αm RNA和蛋白的表达,也不能促进HIF-1α的降解,证明PCIF1通过m6Am甲基化转移酶的功能,下调HIF-1α的蛋白表达。3.通过qRT-PCR发现,过表达PCIF1可以显著增加低氧条件下PHD2 m RNA的表达,增加其m RNA稳定性,而甲基化转移酶位点突变后,其功能丧失。结论:PCIF1介导的m6Am修饰在PAH这一疾病过程中发挥着重要作用,PCIF1通过其甲基转移酶的作用增加PHD2 m RNA的稳定性,负向调控HIF-1α的表达及其下游通路,从而抑制PASMCs增殖、缓解PAH的血管重塑。