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【研究背景和目的】胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其早期诊断困难,一旦确诊,多为中晚期患者。尽管胃癌的诊断和治疗取得了较大进展,但其死亡率仍居高不下,五年生存率仍无明显改善。侵袭和转移是胃癌患者预后差的主要原因,甚至一些早期胃癌都可以发生邻近组织或远处组织的转移。因此,探索胃癌侵袭转移的分子机制,对胃癌的治疗具有重要的临床意义。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,h TERT)是端粒酶的一个亚单位,其表达直接决定了端粒酶的活性。过去有关h TERT的研究大多集中在延长和维持端粒长度以及促进细胞增殖等功能上,而少有文献报道其与细胞侵袭转移的关系。课题组前期的研究发现,抑制胃癌端粒酶活性可以明显降低胃癌细胞的体外侵袭能力;而在端粒酶阴性的U2OS骨肉瘤细胞中过表达hTERT,可以促进该细胞的体内外侵袭及转移能力。Meta分析表明,端粒酶及其hTERT亚单位的活化与胃癌患者的淋巴结迁移以及远处迁移密切相关。以上研究提示,端粒酶及其h TERT亚单位的异常活化与胃癌的侵袭转移密切相关。但h TERT参与调控胃癌侵袭转移的机制并不十分清楚。Wnt信号通路在胃癌的侵袭转移过程中具有重要作用。有研究表明,在胃癌细胞中,h TERT能够与β-catenin相互作用,促进其入核并增强其转录活性,从而活化经典Wnt信号通路,促进胃癌细胞的侵袭转移。然而本课题组研究发现,在Wnt信号不活化的HCT116结肠癌细胞中过表达h TERT,仍能增强其侵袭转移的能力,提示h TERT还有可能通过其他途径促进胃瘤细胞的侵袭转移过程。Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎发育、组织分化、维持组织稳态有着重要作用,当它被异常活化时,参与了肿瘤的发生发展全过程。经典的Hh信号通路主要由配体Hedgehog、跨膜蛋白受体Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)以及转录因子Gli家族构成。Gli家族是Hh信号通路的核心,Gli的激活将导致其下游一系列分子的转录,进而完成Hh信号通路对生命的各个进程的调控作用。有研究表明,Hh信号通路的活化参与了包括胃癌在内的多种肿瘤的侵袭、转移过程。关于Hh/Gli信号通路是否也参与了htert对胃癌侵袭转移的调控及其分子机制,目前尚无文献报道。因此,本课题拟从胃癌临床标本入手,研究胃癌组织中htert、gli1、gli2表达以及与胃癌患者临床病理之间的关系,并探讨htert与gli1和gli2是否存在相互关联;然后进一步从细胞学水平研究htert转染是否可能促进gli1和gli2的表达,在胃癌的侵袭转移中发挥作用,为基于htert的胃癌治疗提供理论依据。【研究方法】第一部分:胃癌组织中人端粒酶逆转录酶与gli1、gli2表达相关性的研究1.采用免疫组化方法检测72例胃癌患者的胃癌及其癌旁组织中htert、gli1、gli2的表达;2.根据72例胃癌标本中htert和gli1、gli2表达,分别统计分析htert和gli1、htert与gli2之间的关系;3.根据72例胃癌标本中htert和gli1、gli2表达,分别统计分析三者与胃癌患者临床病理之间的关系;4.根据72例胃癌标本中htert和gli1、gli2表达,分别统计分析三者与胃癌患者预后之间的关系。第二部分:htert促进胃癌gli1表达的分子机制研究1.采用western-blot检测7株胃癌细胞中htert、gli1的基础表达;2.采用实时荧光pcr检测bgc-823、sgc-7901转染htert24小时后gli1mrna的表达情况;3.采用western-blot检测bgc-823、sgc-7901转染htert24小时后gli1蛋白表达情况。【研究结果】第一部分:胃癌组织中人端粒酶逆转录酶与gli1、gli2表达相关性的研究1.免疫组化结果表明,htert、gli1、gli2三者在胃癌组织中的表达较癌旁组织均明显升高(p<0.01);2.72例胃癌相关性分析得到htert与gli1,htert与gli2之间均存在正相关性,其相关系数分别为r=0.502(p<0.01)、r=0.6246(p<0.01);3.72例胃癌htert、gli1、gli2高表达均与淋巴结转移密切相关(p<0.05),且gli1高表达还与胃癌患者远处转移有关(p<0.05);4.h TERT、Gli1均高表达组和hTERT、Gli2均高表达组预后较差(p<0.05、p<0.05),三者均高表达组预后最差(p<0.01)。第二部分:hTERT促进胃癌Gli1表达的分子机制研究1.Western-blot筛选出h TERT表达量相对较低的细胞系,即BGC-823、SGC-7901;2.BGC-823、SGC-7901转染了hTERT质粒24小时后,实时荧光PCR检测得到BGC-823、SGC-7901中Gli1 m RNA水平升高;3.BGC-823、SGC-7901转染了h TERT质粒24小时后,western-blot检测得到BGC-823、SGC-7901中Gli1蛋白水平升高。【研究结论】1.临床研究提示,hTERT和Gli1、Gli2在胃癌中均高表达且具有正相关性,三者高表达与淋巴结转移均相关,h TERT、Gli1均高表达组和h TERT、Gli2均高表达组预后较差,三者均高表达组预后最差;2.体外实验证实过表达h TERT后,可明显上调胃癌细胞Gli1的m RNA和蛋白表达水平,从而促进胃癌细胞的侵袭转移过程。综上,胃癌中h TERT还有可能通过促进Gli1的表达,活化Hh信号通路,从而促进胃癌细胞的侵袭转移过程。