【摘 要】
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目的水通道蛋白（aquaporins,AQPs）作为一种跨膜蛋白,在维持细胞水稳态方面起着重要作用。近年来已被证实在多种组织中参与细胞间粘附、细胞迁移、细胞增殖等多种细胞功能,本研究旨在探讨水通道蛋白5（aquaporin 5,AQP5）在角膜上皮损伤修复中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技术构建以C57BL/6N小鼠为背景的AQP5基因敲除(AQP5-/-)小鼠。选取相同周龄的C57BL/
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目的水通道蛋白（aquaporins,AQPs）作为一种跨膜蛋白,在维持细胞水稳态方面起着重要作用。近年来已被证实在多种组织中参与细胞间粘附、细胞迁移、细胞增殖等多种细胞功能,本研究旨在探讨水通道蛋白5（aquaporin 5,AQP5）在角膜上皮损伤修复中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技术构建以C57BL/6N小鼠为背景的AQP5基因敲除(AQP5-/-)小鼠。选取相同周龄的C57BL/6N小鼠作为AQP5+/+小鼠与AQP5-/-小鼠进行实验。通过对小鼠进行角膜上皮刮除术,建立AQP5+/+和AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤模型。使用荧光素钠、β-tubulin III和Ki-67分别作为角膜上皮缺损、角膜神经和角膜上皮增殖的标志物对小鼠角膜进行染色。用蛋白质印迹法和免疫荧光染色对角膜上皮神经再生相关信号磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt,p-Akt）和神经生长因子（nerve growth factor,NGF）进行检测。通过外源性给予NGF和Akt抑制剂（Akt inhibitor,Akti）对AQP5-/-小鼠进行干预诱导,观察小鼠角膜上皮损伤修复速度和神经再生情况。结果（1）AQP5在AQP5+/+小鼠角膜上皮细胞的细胞膜中广泛表达,而在AQP5-/-小鼠角膜上皮细胞中几乎不表达。并且与AQP5+/+小鼠相比,AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤修复速度和神经再生速度明显延迟。（2）对小鼠角膜进行神经染色和敏感度测量发现,与AQP5+/+小鼠相比,AQP5-/-小鼠神经纤维密度和角膜敏感度均明显下降。（3）与AQP5+/+小鼠相比,无论是否对小鼠进行角膜上皮刮除术,AQP5-/-小鼠角膜上皮中Ki-67阳性细胞数量、NGF和p-Akt表达水平均明显减少,提示了AQP5基因敲除后,小鼠角膜上皮细胞增殖能力和神经再生能力可能存在缺陷,并且可能通过影响Akt信号通路激活进而抑制角膜上皮损伤修复速度和神经再生。（4）对AQP5-/-小鼠外源性给予NGF进行干预治疗,发现NGF治疗组的小鼠角膜上皮损伤修复和神经再生速度显著快于PBS处理组,并且伴有p-Akt表达水平的增加。（5）对AQP5-/-小鼠外源性给予NGF进行干预治疗,AQP5-/-小鼠角膜神经纤维密度和角膜敏感度明显增加。（6）Akti阻断了NGF对AQP5-/-小鼠的角膜上皮损伤修复和神经再生速度的促进作用。结论本研究发现AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤修复速度的抑制是由于角膜上皮细胞增殖和神经再生的明显缺陷所致。这一结果为水通道蛋白参与细胞增殖和神经再生的过程提供了证据,并提示AQP5是加速角膜缺损修复的一种可能的治疗靶点。
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